LPS 诱发绵羊精子活力降低及TLR4 基因的介导作用

陆 奇，韩修远，赵 亮，刘 爽，亓美玉，姚玉昌*

（1.黑龙江普通高等学校动物遗传育种与繁殖重点实验室，黑龙江哈尔滨 150030；2.东北农业大学动物科学技术学院，黑龙江哈尔滨 150030；3.黑龙江省农业科学院畜牧研究所，黑龙江哈尔滨 150086）

精液质量是影响动物繁殖效率的重要因素。哺乳动物精子在生殖道内运行的过程中易受到细菌和病毒污染。由于大肠杆菌（）、肺炎克雷伯菌（）、奇异变形杆菌（）等革兰氏阴性菌污染，会导致精子活力和受精能力下降，造成雌性受胎率降低，严重时雄性动物会丧失生育能力，给畜牧业生产带来严重损失。

精子活力是成功受精的基本保证。普遍认为精子中段的线粒体缺陷可能是精子活力受损的重要原因，进而影响精子顶体反应、获能、与透明带相互作用、精卵细胞融合等关键的能量依赖过程。有研究表明，精液中细菌污染主要通过增加精子中ROS 水平对线粒体功能造成损伤。适度低水平的ROS 是保证精子活力的要素，但异常高水平的ROS 将导致精子膜流动性发生不可逆的改变，造成精子活力下降，并持续破坏精子顶体反应和获能，进一步造成精子DNA 片段化。因此，精液中细菌污染可能通过损伤线粒体功能来降低精子活力。

革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分脂多糖（Lipopoly saccharide，LPS），具有雄性生殖毒性，可诱发精子内ROS 的产生，损伤线粒体功能，进而降低精子活力。（）作为LPS 的主要模式识别受体，被LPS 激活后，可在多种细胞中诱发炎症、凋亡、氧化应激等生物学反应。因此，本研究以LPS 作为模拟物处理绵羊精子，拟阐明精液中革兰氏阴性菌污染对精子活力、线粒体结构及功能的损伤，并揭示基因在此过程中的介导作用，为解析细菌侵染导致精子损伤的机制提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物及样品收集 选择健康、体况良好、无繁殖疾病的2～3 岁德国肉用美利奴公羊8 只，其中过表达基因公羊和野生型公羊各4 只，饲养于东北农业大学绵羊新品种培育基地，每日提供全价精饲料 0.7 kg，自由采食饲草和饮水。利用常规假阴道方法采集公羊精液，经现场外观初评后，立即送至实验室检测精子活力。

1.2 精子上浮 精液经外观评定及活力检测合格后，立即使用37℃预热的精子BWW 培养液（HLCM0052，上海哈灵生物科技有限公司）完成精子上浮操作。具体操作步骤如下：精液经BWW 培养液等体积稀释后，吸取200 μL 稀释精液缓慢加于装有2 mL 培养液离心管的底部，移入37℃、5% CO环境的培养箱中倾斜45°放置30 min，使用剪掉尖端的枪头吸取适量的上浮精子悬液，用于活力及纯度检测。

1.3 上浮精子纯度鉴定 为避免精液中白细胞、上皮细胞、睾丸组织细胞等体细胞污染对精子试验产生影响，本研究采用CD4、E-Cadherin 和c-kit 基因作为细胞标志物检测上浮后精子样品。收集原精以及上浮精子样品，3 000 r/min 离心10 min 后，利用QIAGEN RNeasy Mini Kit（7410474106，Qiagen）提取总RNA，Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit（04897030001，Roche）合成cDNA，具体操作步骤按照试剂盒说明书执行，产物置于-20℃冰箱保存，用于精子纯度检测。精子纯度鉴定所用的引物信息见表1，交由南京金唯智生物技术公司合成。

表1 PCR 引物序列

1.4 精子培养 将上浮纯化后的精子调整浓度至2×10/mL，置于12 孔板中，37℃、5% CO条件下培养。设置对照组、LPS（1 μg/mL）处理组（L4391，Sigma）、TAK-242（3 μmol/L）处理组（Cli095，Invivogen）和TAK-242（3 μmol/L）+LPS（1 μg/mL）共处理组，其中共处理组利用TAK-242 提前预处理30 min。每组设置3 个重复孔，分别于处理后的2、4 h 和6 h 收集样品用于后续分析。

1.5 精子活力检测 将样品放置于37℃温控板上，利用SCA 全自动精子质量分析仪(Sperm Class Analyzer)中的绵羊物种模块检测精子活力和质量。以精子活力抑制率作为评价精子活力的指标，活力抑制率=0 h 时精子活力百分数值-各检测时间点精子活力百分数值。

1.6 精子基因表达检测 利用免疫荧光方法检测精子外膜基因表达，操作过程如下：培养后的精子（1×10/mL）经推片后，PBS 浸洗3 次，BSA（A1933，Sigma）封闭2 h；一抗（AF7107，Affinity）4℃孵育过夜，加入cy3 标记的二抗避光孵育1 h，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，而后在荧光显微镜（Χ71，Olympus）下察看采集图像。

1.7 精子线粒体超微结构检测 将精子样品利用2.5%戊二醛和1% 锇酸固定，按照50% 乙醇8～10 min、70% 乙醇8～10 min、90% 乙醇8～10 min 和100% 乙醇8～10 min 的顺序梯度脱水，树脂包埋后切片，经醋酸铀和柠檬酸铅双染色后，利用透射电子显微镜（JEOL-1200EΧ，日本）观察精子线粒体结构并拍照。

1.8 精子线粒体膜电位检测 利用JC-1 膜电位检测试剂盒（65-0851-38，eBioScience）分析线粒体膜电位的变化，具体操作步骤如下：取1 mL 培养后的精子样品（1×10/mL），以1000 r/min 低速离心5 min 后获得样品沉淀，加入200 μL JC-1（2.5 μg/mL）工作液，将样品重悬后37℃孵育15 min，低速离心后的沉淀利用PBS 重悬，流式细胞仪上机检测（FACS Calibur，美国BD 公司）。

1.9 精子ATP 水平检测 利用ATP 合酶酶活性检测试剂盒（ab109714，Abcam）分析精子中ATP 水平，具体操作步骤如下：利用蒸馏水将ATP 标准溶液稀释为10～10mol/L 的梯度浓度，加入100 μL 细胞裂解液后，根据ATP 梯度荧光值绘制标准曲线；加入100 μL 细胞裂解液至待测精子样品中（1×10/mL），将样品荧光值带入标准曲线得到ATP 水平检测值。

1.10 统计分析 利用SPSS 18.0 软件对数据进行单因素方差分析（ANOVA）分析和Duncan 多重比较。*代表＜0.05，表示差异显著；** 代表＜0.01，*** 代表＜0.001，表示差异极显著。所有数据均为平均值±标准误。

2 结果与分析

2.1 上浮处理后提高了精子样品的活力和纯度 研究结果表明，精子经上浮操作后精子活力提升（＜0.05），由初始活力78%，提升到90%（图1）。

图1 绵羊精子上浮前后活力

图2 表明，精子经上浮处理后，纯度较高，无明显的白细胞（作为标记基因）、上皮细胞（作为标记基因）以及睾丸组织细胞（c-kit 作为标记基因）的污染，可用于进一步研究。

图2 上浮后精子中体细胞污染检测

2.2 LPS 对精子活力的影响 图3 表明，随着培养时间延长精子活力逐渐下降。精子经LPS（1 μg/mL）处理后，在6 h 时精子活力抑制率高于对照组（＜0.001），精子活力呈现较大幅度的下降。因此，本研究后续分析均选择培养6 h 时的样品。

图3 LPS 处理后绵羊精子活力变化

2.3基因对LPS 诱发的精子活力下降的影响 免疫荧光染色结果表明，基因在绵羊精子外膜上表达；精子经LPS（1 μg/mL）处理后基因表达上调（＜0.001），同时其表达位置发生变化，由主要表达在精子头部向尾部扩展（图4-A）。LPS 处理后6 h精子活力下降（＜0.001）（图4-B、C），前向运动率和非前向运动率均降低（＜0.05），不运动精子率极显著升高（＜0.001）（图4-D）。但精子经LPS 处理后，过表达基因对其活力、前向运动率、非前向运动率、不运动精子率均无显著影响；利用TAK-242抑制TLR4 信号通路缓解了LPS 诱发的精子活力下降（＜0.001），但对前向运动率、非前向运动率、不运动精子率无显著影响。

图4 绵羊精子TLR4 基因的表达及其表达水平对LPS 处理后精子活力的影响

2.4 LPS 对精子线粒体结构的影响 精子经LPS（1 μg/mL）处理后，线粒体结构发生明显变化，主要表现为线粒体排列不规则、膜间隙肿胀（Swollen，SW）和定向障碍（Disorientation，di），并产生大量液泡（Vacuole，Va）结构（图5）。

图5 LPS 处理后精子线粒体结构变化

2.5基因对LPS 诱发的线粒体膜电位和ATP 水平降低的影响 精子线粒体膜电位（JC-1）检测结果表明（图6-A），与对照组相比，精子经LPS 处理6 h 后其膜电位水平降低（＜0.001），虽然过表达基因对线粒体膜电位无显著影响，但TAK-242 处理后对缓解线粒体膜电位水平降低具有明显作用（＜0.05）。ATP 水平的检测结果表明（图6-B），与对照组相比，经LPS 处理6 h 后，精子中ATP 水平降低（＜0.001），同样地，过表达基因对精子中ATP 水平无显著影响，而TAK-242 处理缓解了ATP 水平的降低（＜0.001）。

图6 LPS 刺激后精子线粒体膜电位和ATP 变化

3 讨 论

细菌感染对动物和人类精子的发生过程造成不利影响，如金黄色葡萄球菌感染可引起少精子症（Oligospermia）、弱精子症（Asthenospermia）、畸形精子症（Teratospermia）和无精子症（Azoospermia）。大肠杆菌作为泌尿生殖系统感染的主要菌株可引起前列腺炎，造成睾丸损伤进而影响精子成熟；同时，细菌来源的LPS 也可破坏睾丸类固醇激素以及精子的发生，并诱导暂时性不育和睾丸功能障碍。细菌感染除损伤精子发生过程以外，也会导致成熟精子活力和受精能力下降，造成雌性受胎率降低，严重时雄性动物会丧失生育能力。在人类和猪上的相关研究也表明，LPS 显著影响精子的活力和凋亡，造成其穿透粘性介质的能力下降。本研究中，大肠杆菌来源的LPS 刺激绵羊精子后精子活力下降，前向运动率和非前向运动率均显著降低，不运动精子率升高，导致精液质量下降。

精子的活力与能量代谢密切相关。线粒体作为精子的主要供能单位，在ATP 和ROS 产生方面与其他细胞中的线粒体类似，还参与着精子获能以及顶体反应。对人类精子的研究表明，由细菌侵染引起的精子线粒体缺陷是导致男性不育的主要原因，将精子与支原体、溶血链球菌以及大肠杆菌共孵育后，造成线粒体的活性受损、氧化还原能力降低。线粒体出现结构损伤、ROS含量增加、膜电位降低均会造成线粒体功能障碍进而导致精子活力降低。本研究发现LPS 刺激绵羊成熟精子后，线粒体结构发生变化，表现为线粒体排列不规则、膜间隙肿胀（SW）和定向障碍（di），并产生大量液泡（Va）结构。有研究表明，线粒体结构异常会引起细胞色素氧化酶（Cytochrome Oxidase，CCO）、琥珀酸脱氢酶（Succinodehydrogenase，SDH）和乳酸脱氢酶同工酶（Lactate Dehydrogenase Isoenzyme，LDH）等多种与能量代谢相关的酶类含量发生变化，进而影响精子的能量供应，造成精子运动障碍。同时，线粒体膜电位和ATP 水平极显著降低。这与之前的报道一致，即无论是细菌还是其提纯的毒素如LPS 均可以直接或间接地负面影响精子的线粒体，引起线粒体功能下降，导致精子质量受损，从而降低精子的受精能力。正常的线粒体膜电位是保证ATP 产生的必需条件，是反映线粒体功能的主要指标，ATP 水解后释放能量维持精子的运动和活力。因此，LPS 刺激后引起精子线粒体结构和功能损伤，导致精子的活力下降，造成受精能力降低。

TLR4 作为LPS 的主要模式识别受体，可特异性识别LPS，进而在多种细胞中激活炎症、凋亡、氧化应激等生物学反应。近年来的研究表明，细菌除了通过白细胞和细胞因子等对精子造成损伤外，也可直接作用于精子进而影响精子的活力。有研究发现基因在精子顶体部位表达，白细胞精子症将引起其表达水平上调。本研究中，为阐明LPS 对绵羊成熟精子的直接作用，避免精液中白细胞、上皮细胞以及睾丸组织细胞等对试验的干扰，采用上浮法获得了高纯度的精子样品，用于进一步分析，结果表明LPS 刺激后精子表面基因表达上调，同时其表达位置由头部向尾部扩展。LPS 刺激精子后，过表达基因对精子活力、线粒体膜电位、ATP 水平均无显著影响；而抑制TLR4信号通路后，缓解了LPS 诱发的精子活力、线粒体膜电位水平和ATP 水平的降低。Barbonetti 等研究发现，LPS 可以通过TLR4/CD14 途径抑制精子线粒体膜电位，这与本实验结果相似。因此，TLR4 信号通路在介导LPS 诱发的绵羊精子活力降低、线粒体功能障碍方面扮演着重要角色。

4 结 论

本研究采用上浮法获得高活力、高纯度的绵羊精子样品，LPS（1 μg/mL）处理6 h 后，精子活力降低、线粒体结构及功能受损；同时，精子表面基因的表达上调，表达位置由头部向尾部扩展；过表达基因对精子活力、线粒体结构及功能无显著影响，抑制基因缓解了LPS 诱发的精子损伤。因此，TLR4信号通路在介导LPS 诱发的绵羊精子活力降低、线粒体功能障碍方面扮演着重要角色。