麻风树JcWRI1基因克隆及功能分析

谢佳彤　孙丽丹　陈晓曼　方彤彤　张苗苗　赵雨凡　杨冉　王琦媛　杨同文　唐跃辉

摘要：WRI1是AP2类转录因子的成员，在植物生长发育和脂肪酸合成途径中起着重要的调控作用。通过RT-PCR技术从麻风树中克隆了1个AP2家族基因，将其命名为JcWRI1。JcWRI1基因开放阅读框全长1 137 bp，编码378个氨基酸。表达模式分析结果表明，在麻风树种子胚中没有检测到JcWRI1基因的表达，然而该基因在麻风树种子胚乳中高表达。亚细胞定位结果表明，JcWRI1基因编码1个核定位蛋白质。表型分析结果表明，提高JcWRI1基因的表达量不影响转基因水稻的生长发育，但是改变了转基因植株叶片、胚乳中脂肪酸组分的含量，并且提高了转基因水稻叶片、胚乳中的含油量。qRT-PCR结果表明，脂肪酸合成相关基因在JcWRI1转基因水稻中的相对表达量显著高于野生型。研究结果为将来研究JcWRI1基因在麻风树种子胚乳发育及油脂代谢途径中的功能提供了理论依据和新的基因资源。

关键词：麻风树;JcWRI1;AP2家族;转基因水稻;胚乳

中图分类号：S727.32文献标识码：A文章编号：1000-4440（2022）02-0334-09

Cloning and functional analysis of JcWRI1 gene from physic nut

XIE Jia-tong，SUN Li-dan，CHEN Xiao-man，FANG Tong-tong，ZHANG Miao-miao，ZHAO Yu-fan，YANG Ran，WANG Qi-yuan，YANG Tong-wen，TANG Yue-hui

Abstract：WRI1 is a member of AP2 transcription factors and plays an important regulatory role in plant growth and development and fatty acid synthesis. In this study， an AP2 family gene was cloned from physic nut by RT-PCR and named JcWRI1. The open reading frame of JcWRI1 gene was 1 137 bp in length， encoding 378 amino acids. The results of expression pattern analysis showed that the expression of JcWRI1 gene was not detected in the embryo， but it was highly expressed in the endosperm. The subcellular localization results indicated that the JcWRI1 gene encoded a nuclear localization protein. Phenotypic analysis revealed that the increase of JcWRI1 gene expression did not affect the growth and development of transgenic rice， but changed the fatty acid composition in the leaves and endosperm of transgenic plants and increased the oil content in the endosperm and leaves of transgenic rice. The results of qRT-PCR showed that the relative  expression of fatty acid synthesis-related genes in JcWRI1 transgenic rice was significantly higher than that in wild-type rice. The results provide a theoretical basis and new genetic resources for further research on the function of JcWRI1 gene in the endosperm development and lipid metabolism pathway of physic nut.

Key words：physic nut;JcWRI1;AP2 family;transgenic rice;endosperm

江蘇农业学报2022年第38卷第2期

谢佳彤等：麻风树JcWRI1基因克隆及功能分析

油不仅是生产食物的原料，也是一种重要的工业原料，具有巨大的经济价值。在植物种子中，三酰基甘油（TAGs）作为一种主要的储存化合物，能够为种子发育和幼苗生长提供碳源和能量[1]。TAGs是甘油和脂肪酸酯化的产物，通过基因工程的方法提高TAG代谢途径关键酶基因GPAT、LPAT、DGAT的表达量，能够增加植物种子的含油量[2-4]。近年来，控制脂肪酸合成途径中多种酶活性的转录因子已经引起研究者的广泛关注。

WRI1是AP2类转录因子家族成员，包含2个保守的AP2/ERF结构域，首次是从种子表皮有皱纹的拟南芥突变体中分离出来的，命名为WRINKLED1[5]。此外，在种子发育过程中，WRI1突变体种子不能将葡萄糖、蔗糖转化为脂肪酸合成的前体，并且种子含油量降低了80%[5]。相反，以WRI1突变体为受体，过表达AtWRI1基因不仅可以恢复突变体正常的种子外观，而且与野生型相比增加了种子的含油量[6]。在玉米中，过表达ZmWRI1不影响转基因植株种子萌发、叶片发育和作物产量，然而会增加转基因植株种子的含油量[7]。在大豆中，提高GmWRI1b基因的表达量增加了大豆种子的含油量[8]。此外，在拟南芥中过表达油菜BnWRI1基因后，通过上调脂肪酸合成基因EAR的表达量增加了种子的含油量[9]。综上所述，尽管不同物种的WRI1基因已经被克隆并进行了功能分析，然而这些物种的油脂主要积累在种子胚中，而目前与油脂在植物种子胚乳中积累相关的WRI1基因是否拥有相似功能的研究较少。因此，挖掘与油脂在种子胚乳中积累相关的WRI1基因并对其调控机制进行研究，对于胚乳油脂含量的提高具有重要理论意义。

麻风树，又名小桐子，是一种多用途的木本植物，具有抗旱、耐盐碱、耐贫瘠、胚乳含油量高等特点，已被广泛认为是最适宜用于生产生物柴油的能源植物之一[10]。在本研究中，笔者克隆了1个麻风树AP2家族转录因子基因，将其命名为JcWRI1，并在水稻中分析该基因的功能，以期为麻风树及其他作物高含油品种的培育提供新的基因资源和理论依据。

1材料与方法

1.1材料与试剂

本试验所用的麻风树品种为GZQX0401自交系，水稻材料为粳稻中花11（ZH11）。取麻风树授粉后29 d、35 d、41 d、45 d种子的胚、胚乳用于表达模式分析。本试验所用高保真酶、T4 DNA连接酶、pMD18-T载体、限制性内切酶等试剂均购自宝生物工程（大连）有限公司。

1.2基因克隆与植物表达载体的构建

按JcWRI1基因序列设计特异性引物，以麻风树种子cDNA为模板，通过RT-PCR技术克隆获得JcWRI1基因序列，电泳回收后将用RT-PCR技术扩增得到的目的基因连接到pMD18-T载体上，转化、扩大培养、提取质粒后送北京奥科鼎盛生物科技有限公司测序，随后将测序正确的目的基因从pMD18-T载体切下来，最后通过T4 DNA连接酶将回收的目的基因连接到植物表达载体上，再次将构建好的植物表达载体送北京奥科鼎盛生物科技有限公司测序，确保目的基因正确连接到植物表达载体上后，将植物表达载体转入农杆菌EHA105中保存待用。

1.3JcWRI1基因编码蛋白质的亚细胞定位分析

以麻风树种子cDNA为模板，通过RT-PCR技术克隆获得JcWRI1基因的全长编码序列（不含终止密码子），再将测序正确的序列连接到亚细胞定位载体p-GFP上，形成JcWRI1-GFP融合表达载体。然后将空载体和JcWRI1-GFP融合表达载体通过聚乙二醇（PEG）介导的方法转移到拟南芥原生质体细胞中，在荧光共聚焦显微镜下观察定位结果。

1.4转JcWRI1基因水稻的获得

本研究以ZH11愈伤组织为受体，通过农杆菌EHA105介导的转化法将构建好的JcWRI1表达载体通过转基因方法转化到水稻中[11]，通过潮霉素筛选、β-葡萄糖苷酸酶（GUS）染色初步确定转基因植株，最后通过RT-PCR技术检测JcWRI1基因在野生型（WT）、转基因水稻植株[包括转JcWRI1基因水稻1号株系（OE1）、转JcWRI1基因水稻2号株系（OE2）、转JcWRI1基因水稻3号株系（OE3）]中的表达情况，最终确定有效转基因植株，并挑选3株用于后续研究。

1.5转JcWRI1基因水稻的表型分析

野生型和转基因水稻种子萌发后，挑选生长一致的幼苗并将其转移到水稻营养液中继续生长，14 d后进行表型分析，选取30株幼苗，统计其根长和株高。

1.6野生型和转基因水稻种子脂肪酸、淀粉含量的测定

脂肪酸组分的测定参考前人的研究方法[12]，所选材料为成熟的野生型水稻、转JcWRI1基因水稻纯合体种子和剑叶，首先称取50 mg种子，用三氯甲烷彻底清洗后放入10 ml玻璃瓶中，随后加入1 ml 5%（体积分数）H2SO4甲醇溶液、300 μl甲苯，并补充20 μl 0.2%（质量体积比）丁基羟基甲苯溶液，以C17∶0作为内标（40 μl），然后将玻璃管在90 ℃加热1.5 h。冷却至室温后，加入1 ml 0.9%（质量体积比）NaCl并混合均匀，随后加入2 ml己烷并混合均匀，并在室温下4 000 r/min离心5 min，接着将上层溶液转移到新的玻璃管中，向新的玻璃管中加入2 ml己烷并混合均匀，在室温、4 000 r/min条件下离心5 min，然后将上层溶液转移到新玻璃管中，最后使用配备火焰离子化检测器（FID）的Agilent 7890A GC系统仪器在HP-88色谱柱（30.00 mm×0.25 mm内径，膜厚0.20 μm）上通过气相色谱（GC）分析脂肪酸甲酯提取物。用野生型、转基因水稻植株成熟的种子胚乳检测淀粉含量，具体操作方法参考淀粉总量试剂盒（莱尔生物医药科技有限公司，货号：K-TSTA-100A）说明书。

1.7野生型和转基因水稻植株含油量的测定

所用材料为成熟的野生型、转基因水稻胚乳和剑叶。首先将胚乳磨碎并于80 ℃烘干，将叶片去除叶绿素后于80 ℃烘干。将去除叶绿素后磨碎的叶片粉末在干燥器中冷却后称质量，再将磨碎的粉末放入10 ml离心管中，然后加入2 ml异丙醇且于85 ℃水浴10 min，冷却至室温后，加入3 ml正已烷并静置5 min，然后剧烈振荡，接着加入2.5 ml 15% Na2SO4上下颠倒后，将上层溶液转入1个新的玻璃管中，下层再加入5 ml正己烷-异丙醇（体积比7∶2）再次萃取。最后将玻璃管中萃取得到的有机相用氮气吹干，烘干过夜后在干燥器内冷却，再次称玻璃管质量。种子、叶片含油率=（含油玻璃瓶质量-玻璃瓶质量）/种子质量×100%。

1.8RNA的提取及基因表达情况的检测

本研究所用材料中RNA的提取均采用赛默飞世尔科技（中国）有限公司的RNA提取试剂盒（货号：12183025），cDNA链的合成采用TaKaRa公司的逆转录试剂盒（货号：6215A）。定量PCR采用LightCycler480 Ⅱ实时荧光定量PCR仪和TB Green Fast qPCR Mix试剂盒，具体操作方法参照试剂盒说明书。分别用OsUbiquitin、JcActin作为水稻、麻风树的内参基因，用2-△△Ct计算基因的相对表达水平，本研究所需引物序列见表1，所有试验均进行3次生物学重复。

2结果与分析

2.1JcWRI1基因的生物信息学分析

设计特异性引物，以麻风树种子cDNA为模板，通过RT-PCR技术克隆出JcWRI1基因，随后进行测序并通过美国国立生物技术信息中心（NCBI）网站的BlastP程序进行比对。比对结果表明，该基因开放阅读框全长1 137 bp， 编码378个氨基酸（GenBank登录号：JCGZ_09727）。多序列比对结果表明，JcWRI1基因编码的蛋白质含有2个保守的AP2/ERF结构域，且与拟南芥AtWRI1蛋白、水稻OsWRI1蛋白高度同源（圖1）。此外的研究结果表明，在拟南芥中，第1个AP2/ERF结构域中的VYL基序对于维持AtWRI1在调控植物发育方面的功能是至关重要的[13]。本研究结果表明，VYL基序也存在于JcWRI1蛋白序列中（图1）。说明，VYL基序在WRI1蛋白中是高度保守的。

字母底色为深色表示保守氨基酸;字母底色为浅色表示不保守氨基酸;划线部分表示AP2/ERF区域。

2.2JcWRI1基因的表达模式分析

对麻风树不同组织及种子不同发育时期的转录组测序结果表明，JcWRI1基因在根、茎和叶中没有检测到表达，仅在种子中检测到高表达。为了验证转录组测序结果的可靠性，通过qRT-PCR技术检测JcWRI1在麻风树种子不同发育时期的胚、胚乳中的表达。结果表明，在麻风树种子胚中没有检测到JcWRI1基因表达，仅在胚乳中检测到JcWRI1基因的表达，且在授粉后35 d的胚乳中相对表达量最高（图2）。说明，JcWRI1基因也许在麻风树种子发育过程中起重要的调控作用。

2.3JcWRI1基因编码蛋白质的亚细胞定位分析

为了明确JcWRI1蛋白的特性，通过RT-PCR克隆了JcWRI1开放阅读框序列（不含终止子），测序后通过酶切连接的方法构建了JcWRI1-GFP融合表达载体。随后通过PEG介导的拟南芥原生质体转化的方法将空载体和JcWRI1-GFP融合表达载体分别转化到拟南芥原生质体细胞中。于25 ℃过夜培养后，将拟南芥原生质体细胞置于荧光共聚焦显微镜下观察定位情况。结果表明，空载体转化的细胞中所有细胞器中都检测到了绿色荧光信号，然而在JcWRI1-GFP融合表达载体转化的细胞中，仅在细胞核中检测到了绿色荧光信号（图3）。本研究结果进一步表明，JcWRI1基因编码1个核定位蛋白质。

2.4转JcWRI1基因水稻的表型分析

为了研究JcWRI1基因的生物学功能，本研究构建了JcWRI1基因过表达的转基因水稻植株，并选取3株转基因水稻（OE1、OE2、OE3）用于后续功能研究。RT-PCR结果表明，JcWRI1基因在野生型水稻中没有表达，然而在转基因水稻中高表达。表型分析结果表明，过表达JcWRI1基因不影響转基因水稻根、地上部分的生长发育。统计学分析结果表明，转JcWRI1基因水稻根长、地上部分的高度与野生型植株相比没有明显差异（图4）。为了分析提高JcWRI1表达量是否会影响转基因水稻的生长发育情况，本研究进一步统计了成熟植株的高度，结果表明，野生型、转基因水稻（OE1、OE2、OE3株系）的株高分别为89.52 cm、88.80 cm、88.62 cm和88.90 cm，进一步表明过表达JcWRI1基因不会影响转基因水稻的生长发育。

a.转JcWRI1基因水稻和野生型植株表型分析;b.转JcWRI1基因水稻和野生型株高;c.JcWRI1基因在野生型和转基因水稻中的表达;d.转JcWRI1基因水稻和野生型根长。WT：野生型;OE1：转JcWRI1基因水稻1号株系;OE2：转JcWRI1基因水稻2号株系;OE3：转JcWRI1基因水稻3号株系。

2.5转JcWRI1基因水稻胚乳脂肪酸成分分析

为了明确提高JcWRI1基因表达量是否会影响转基因水稻的脂肪酸成分，通过气相色谱的方法分析了野生型、转基因水稻胚乳的脂肪酸成分。由图5可以看出，水稻胚乳中主要含有C14∶0、C16∶0、C16∶1、C18∶0、C18∶1、C18∶2、C18∶3、C20∶0和C20∶1，其中C16∶0、C18∶1和C18∶2为主要脂肪酸成分，三者占比约为90%。研究结果还显示，与野生型植株相比，转JcWRI1基因植株中C14∶0、C18∶0和C20∶0脂肪酸成分的含量显著低于野生型，然而C16∶1和C18∶1在转基因水稻中的含量显著高于野生型。综上所述，过表达JcWRI1改变了转基因水稻胚乳中脂肪酸成分。

2.6转JcWRI1基因水稻叶片脂肪酸成分分析

为了验证过表达JcWRI1基因是否会影响转基因水稻叶片脂肪酸组分，笔者进一步分析了野生型和转JcWRI1基因水稻旗叶中脂肪酸组分。结果表明，C16∶0、C18∶2和C18∶3为水稻旗叶的主要脂肪酸成分，三者占所有组分的比例为89%;与野生型水稻相比，C16∶1在转基因水稻中的含量显著提高，然而C18∶0在转基因水稻中的含量却显著低于野生型（图6）。

2.7转JcWRI1基因水稻叶片和胚乳中含油量分析

表达模式分析结果表明，JcWRI1基因主要在麻风树胚乳中表达（图2）。此外前人研究发现，麻风树中的油主要积累在胚乳中，且含量高达50%。因此，为了验证JcWRI1基因在麻风树种子胚乳发育中的功能，首先检测了转JcWRI1基因植株种子的千粒质量。图7b结果表明，与野生型水稻相比，转基因水稻种子千粒质量没有显著差异。随后，检测了野生型水稻和转JcWRI1基因水稻种子胚乳中的含油量、淀粉含量，结果表明，与野生型水稻相比，过表达JcWRI1基因显著增加了转基因水稻种子胚乳的含油量（图7a），但是降低了转基因水稻种子胚乳中淀粉含量（图7c）。进一步检测水稻叶片中含油量，结果表明，转JcWRI1基因水稻叶片的含油量明显高于野生型水稻（图7d）。

2.8过表达JcWRI1基因改变脂肪酸合成相关基因的表达

为了阐明JcWRI1基因参与水稻胚乳含油量调控的分子机制，通过qRT-PCR技术进一步检测了脂肪酸合成相关基因在野生型、转基因水稻中的表达情况。结果表明，与野生水稻相比，脂肪酸合成相关基因（KASIII、PDH-E1 β、ENR1、PDH-E2、ACP和PDH-E1α）在转 JcWRI1基因水稻中的相对表达量显著高于在野生型（图8）。表明过表达JcWRI1基因增加了转基因水稻胚乳含油量的部分原因可能是因为上调了脂肪酸合成相关基因的表达量。

3结论与讨论

AP2家族是一类至少包含1个保守AP2/ERF结构域的转录因子，该家族成员在植物生长发育及油脂合成中起重要的调控作用[14-15]。尽管一些物种的AP2转录因子已经被克隆和进行功能分析，但是关于麻风树AP2家族成员的生物学功能研究未见报道。在本研究中，克隆了油脂合成关键调控因子编码基因WRI1在麻风树中的同源基因，将其命名为JcWRI1，并分析了该基因的功能，结果表明，在水稻中过表达JcWRI1基因增加了转基因植株叶片、胚乳中的含油量。

前人研究發现，在玉米中过表达ZmWRI1基因不影响转基因植株叶片的发育[7]。本研究也发现，异位表达JcWRI1基因对转基因植物叶片发育也没有明显影响，且过表达JcWRI1增加了转基因植株叶片的含油量。另外，在拟南芥中异位表达AtWRI1基因增加了转基因拟南芥叶片的含油量，且WRI1突变体对叶片发育没有影响[13]。以上结果表明，JcWRI1基因在调控叶片脂肪酸和三酰基甘油（TAG）合成中的功能是相对保守的。综上所述，WRI1的异位表达可以用来作为提高植物营养器官含油量的有效路径。与野生型相比，拟南芥WRI1突变体胚、胚乳中的含油量都明显降低[5，16-19]。本研究发现，提高JcWRI1基因的表达量增加了转基因植株胚乳中的含油量。可见，WRI1在种子油脂合成中的功能也是相对保守的。

尽管转JcWRI1基因水稻胚乳、叶片的含油量与野生型相比都显著增加，但是胚乳、叶片中的脂肪酸组分差异很大。本研究结果表明，在转基因水稻胚乳中，约30%的脂肪酸被用来合成C18∶1，然而C18∶3含量低于2%。形成鲜明对比的是，在叶片中，含量最高的脂肪酸组分是C18∶3（约为68%），然而C18∶1含量仅为2.8%。本研究为进一步研究麻风树种子发育和作物高油品种的培育提供了新的基因资源和理论依据。

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（责任编辑：徐艳）

收稿日期：2021-11-05

基金项目：2020年度河南省自然科学基金青年项目（202300410520）;2020年度河南省高等学校重点科研项目（21A180028）;2021年度河南省周口师范学院大学生创新创业训练计划项目（S202110478032）;周口师范学院大学生科研创新基金项目（ZKNUD2021073）

作者简介：谢佳彤（2000-），女，河南信阳人，本科，主要从事麻风树基因功能研究。（E-mail）2230439874@qq.com

通讯作者：唐跃辉，（E-mail）yhtang2005@163.com