一株嗜热异养氨氧化细菌的分离鉴定

赵梓君，王 松

（西华大学建筑与土木工程学院，四川 成都 610039）

在堆肥过程中，氮素损失是一个非常关键的问题。大量研究结果表明，堆肥原料、堆肥方式的不同以及堆肥工艺参数控制的不同，氮素损失量平均可达40%[1]，粪便堆肥的氮损失可高达77%[2]。堆肥实际应用过程中氮素损失是不可避免的，其主要损失是堆肥高温阶段NH3的释放[3-4]。在堆肥的升温期间产生大量的铵态氮，至高温期铵态氮的累积会使pH 增加，此时堆体的高pH 和高温破坏了NH3和NH4＋在堆体水相中与NH3·H2O 的动态平衡，使NH3/铵态氮的平衡向生成NH3方向移动并加速了NH3的挥发[5-6]。由于普通的氨氧化细菌无法生存在堆肥的高温期，只有嗜热的自养型氨氧化细菌会在高温期起作用，这样仍旧会使得NH4＋转化为NH3大量挥发，造成大量氮素损失。因此，对嗜热异养氨氧化细菌进行研究，有利于减少堆肥中氮素损失，提高堆肥产品肥效。

目前已有学者从温泉、深海热液出口和畜禽粪便堆肥等地方发现并分离出嗜热氨氧化细菌[7-9]。因此，本实验拟从农村混合（化粪池水、秸秆以及土壤）好氧堆肥高温期样品分离鉴定出嗜热异养氨氧化细菌，为后续学者进行研究提供一些经验和思路。

1 材料与方法

1.1 采样、培养及分析检测

1.1.1 样品采集

样品取自湖南省长沙县某农村地区采集pH 接近7、水体温度为7.2 ℃的化粪池水样、水稻秸秆以及土壤混合好氧堆肥的高温期堆料。

1.1.2 培养基

异养氨氧化细菌培养基：乙酰胺2 g、NaOH1.6g、KH2PO48.2 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、KCl 0.5 g、CuSO4·5H2O 0.5 mg、CaSO4·2H2O 0.5 mg、ZnSO4·7H2O 0.5 mg、FeCl3·6H2O 0.5 mg、pH 值7.0、蒸馏水1 000 mL、121 ℃蒸汽灭菌30 min；固体另添加15 g～20 g琼脂粉。

1.2 富集分离纯化

1.2.1 富集

取本实验堆肥高温期样品10 g 加入90 mL 放有玻璃珠的无菌水中，置于50 ℃的200 r/min 摇床中充分振荡30 min 左右，使菌体胶团尽可能被打散；再将菌液样品以25%比例加入上述液体培养基振荡培养，温度50 ℃，转速200 r/min，其间同样以25%比例转接两次新鲜培养基，经多次富集，得到7 d 富集液。

1.2.2 分离纯化

异养氨氧化细菌的分离纯化采用稀释涂布平板法和平板划线法，取0.05 mL～0.1 mL 稀释富集液，均匀涂布在平板上，再将平板用保鲜膜封起来倒置于50 ℃恒温培养箱中培养至有菌落生成，记录观察菌落的生长情况；根据肉眼菌落数量、形态、颜色、表面状况及染色特征，挑取有代表性的菌落在平板上划线培养直至纯化；将挑取纯化出的各单菌落接种至异养氨氧化细菌液体培养基中，于50 ℃、130 r/min 摇床振荡培养7 d后，吸取两滴7 d培养物置于白瓷比色板上，滴加格利斯试剂两滴，颜色显示为红色，该菌具有氨氧化能力。

1.3 菌株鉴定

形态学鉴定：挑取培养基上单菌落于载玻片上，通过革兰氏染色，在显微镜下观察。

16S rDNA 法：取适量菌液利用细菌基因组DNA提取试剂盒提取DNA，通过PCR 引物扩增细菌的16S rDNA，经过湖南省长沙擎风科技有限公司测序后，将测序结果提交NCBI 进行BLAST 进行对比，初步确定其种属，再通过MEGA-X 进行系统发育分析，建立系统发育分析进化树。

2 结果与分析

2.1 菌株分离纯化

从农村混合好氧堆肥高温期样品中分离出一株具有氨氧化能力的嗜热菌株，经过肉眼观察分离纯化后的单菌落多为圆形，呈现白色，且光滑，如图1所示。通过显微镜观察，该菌菌体呈杆状，有芽孢，经过革兰氏染色后呈现红色，为革兰氏阴性菌，如图2 所示。

图1 氨氧化细菌单菌落

图2 革兰氏染色

2.2 菌株鉴定

将16S rDNA 测序结果提交NCBI 进行BLAST分析，通过MEGA-X、DNAMAN 等软件进行基因序列的比对与系统进化分析，并采用N-J（Neignbor-Johning）法建立系统进化树，如图3 所示。对该目的菌株(ZZJ)进行初步鉴定，结果表明：ZZJ 与KJ842637.1 Aeribacillus pallidus strain TS 12[10]以及MW282865.1 Aeribacillus pallidus strain SURF-15S[11]相似度为100%，因此初步鉴定为Aeribacillus pallidus strain。

图3 菌株ZZJ 的系统进化树

3 结论

本实验从农村混合好氧堆肥高温堆料中分离出一株嗜热异养氨氧化细菌，通过16S rDNA 扩增，经NCBI Blast 检索，该菌基因序列和KJ842637.1 Aeribacillus pallidus strain TS 12 以及MW282865.1 Aeribacillus pallidus strain SURF-15S 有100%相似度，初步鉴定为Aeribacillus pallidus strain，与目前已经发现的部分嗜热氨氧化细菌的属相同，属于芽孢杆菌属。