重组人AMH对卵巢癌细胞侵袭和迁移的影响*

司秀文 罗丽卿 宋向芹 陈洪娜

滨州医学院附属医院 1 检验科 2 血液科，山东省滨州市 256603

卵巢癌是女性生殖器官中最常见的恶性肿瘤之一[1-2]，可发生于任何年龄，其组织学类型多样，卵巢肿瘤主要来源于卵巢上皮细胞，其恶性肿瘤称为上皮性卵巢癌(Epithelial ovarian cancer,EOC)。在妇科恶性肿瘤中，卵巢癌是致死率最高的恶性肿瘤，发病率仅次于宫颈癌和子宫体癌。由于早期其无症状发展，不易发现，确诊时大部分患者已是晚期(Ⅲ期或Ⅳ期),错过了最佳的手术时间，预后很差[3-4]。尽管卵巢癌对基于铂类化合物和紫杉类化合物等的一线化疗药物反应良好，但大多数患者会出现复发或者呈现化疗耐药[5-6]。对于大多数癌症而言，复发和转移是患者死亡的一大特征。有研究表明，重组人AMH可抑制乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌等细胞的增殖[7],本实验研究重组人AMH对人卵巢癌细胞迁移和侵袭的影响，为卵巢癌诊断和治疗提供新的思路，报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 人卵巢癌细胞株SKOV3(滨州医学院附属医院临床实验中心)；Gibco公司的DMEM细胞培养基；杭州四季青公司的胎牛血清；R&D公司的重组AMH抗原；Corning公司的Transwell小室。

1.2 细胞培养 SKOV3细胞培养条件：温度为37℃、饱和湿度、细胞培养箱CO2浓度为5%、培养基为含有10%胎牛血清的DMEM培养基，荧光显微镜高倍镜下观察细胞的生长情况。当细胞生长到融合度达到80%～90%时，用0.25%胰酶消化细胞并传代培养。

1.3 细胞创伤愈合试验检测卵巢癌细胞迁移能力 通过预实验得出浓度为200nmol/L重组人AMH对SKOV3细胞的抑制率可达到65%，选择将浓度是200nmol/L重组人AMH 1ml加入培养的卵巢癌细胞中进行培养48h，经处理的卵巢癌细胞株SKOV3作为观察组，未经重组人AMH处理的卵巢癌细胞株作为阴性对照组，两组细胞分别接种6孔板中，每组平行3个孔，在显微镜下观察，待细胞生长至平铺满地板时，用加样枪把孔板中的培养液吸去，再用PBS冲洗细胞3次，用100μl加样枪的枪尖在融合至完全的单层细胞中间划“(每孔5×105个细胞)一字形”的创伤，此为细胞创伤愈合实验的模型。每组每个标本做3个复孔，进行划痕后，显微镜下观察并记录划痕区间的距离，用PBS溶液冲洗3次，再用低血清浓度的DMEM细胞培养液继续培养。在划痕0h、24h、48h分别在200倍镜下拍照，并用专门的电子尺软件计算划痕细胞两侧的距离，根据迁移速度=迁移距离/迁移时间计算出迁移速度，比较观察组和对照组两组细胞的迁移能力。

1.4 Transwell小室体外细胞侵袭试验检测卵巢癌细胞的侵袭能力 用Transwell培养小室对卵巢癌细胞的体外侵袭能力进行检测。将基质胶Matrigel放于4℃冰箱过夜解冻，在24孔板中放入配套的Transwell小室，每个小室加稀释好的基质胶60μl，放入37℃细胞培养箱中，孵育5h，形成人工基底膜。每组平行3个小室。分别接种重组人AMH处理48h后的细胞和未处理的阴性对照细胞100μl(调整细胞密度5×105/ml)于小室上室，下室中加入600μl含20%胎牛血清的DMEM，把接种后的小室置于37℃、5%CO2浓度细胞培养箱中培养48h。从24孔板中取出小室，PBS冲洗2遍，用棉签小心擦去小室微孔膜上层内的细胞，将小室倒置风干，用结晶紫染色15min，显微镜下取10个视野，拍照，计数,取平均值。计算相对侵袭指数：V2/V1。V2是观察组中穿过小室基质膜的细胞个数，V1是阴性对照组中穿过小室基质膜的细胞个数。每个样本做3个复孔，同时试验重复3次。结果取平均值。

2 结果

2.1 重组人AMH 对卵巢癌细胞SKOV3迁移能力的影响分析 创伤愈合实验中观察组细胞进入划痕区域的细胞数目少，迁移速度慢，观察组细胞迁移速度为(2.99±0.04)μm/h,显著慢于阴性对照组的(9.02±0.06)μm/h，差异有统计学意义(t=244，P=0.01)。见图1。

图1 重组人AMH对卵巢癌细胞迁移的影响

2.2 重组人AMH 对卵巢癌细胞SKOV3侵袭能力的影响 Transwell小室体外细胞侵袭试验显示观察组细胞相对侵袭指数为0.38±0.03，与对照组相比，结果差异有统计学意义(t=40,P=0.01)。见图2。侵袭实验中，用结晶紫染色后(图3)，观察组细胞穿过膜的数目为(15.00±1.00)个，明显少于阴性对照组的(39.70±1.50)个。

图2 重组人AMH对卵巢癌细胞侵袭的影响

图3 重组人AMH对卵巢癌细胞侵袭的影响

3 讨论

卵巢癌是常见的妇科致死率较高的恶性肿瘤之一[8]，常发生于围绝经期妇女,预后较差。由于缺乏典型的早期症状和有效的诊断方法，在超过70%的病例中，卵巢癌患者在发现时已经是晚期[9]，此时进行手术治疗和化疗，不能达到较好的效果。卵巢癌死亡率与诊断分期密切相关,致死率在妇科癌症中居首位。目前，对于卵巢癌的治疗以手术治疗为主，化疗和放疗为辅。而化疗通常不良反应较大，患者往往难以忍受，同时化疗后肿瘤复发率较高，所以寻求新的治疗方法和药物是临床研究的热点。而肿瘤细胞转移往往是患者死亡的一个主要原因，肿瘤是否出现转移是临床决定治疗方案和评估判断预后的一个重要指标。肿瘤细胞的迁移能力和侵袭能力是其转移的一个关键要素。肿瘤转移指肿瘤从母体、原发病灶，通过各种途径，如血液途径、淋巴途径、种植转移、直接蔓延转移到其他地方。肿瘤细胞的迁移和侵袭过程是一个复杂的多因素参与的过程。因此，探索卵巢癌细胞的迁移和侵袭作用机制，寻找新的治疗靶点，提高患者的生存率，改善患者的生存质量有着极其重要的临床意义[10]。

AMH属于转化生长因子β超家庭成员之一，是由二硫键连接而成的相对分子质量为140 000的糖蛋白，其基因位于人的19号染色体短臂上，在人体内的半衰期大约为28h，完全清除大约需要8d，在性腺发育和性别分化过程中起着重要的作用。AMH也称作苗勒管抑制物质(MIS)，能够引起苗勒管的退化，是生殖器官分化发育和卵泡发育的重要调节因子[11]。男性中AMH由睾丸支持细胞产生，促使胚胎中的苗勒管退化，形成男性正常生殖系统，同时参与精子的形成。女性中AMH主要由卵巢中的初级卵泡分泌产生。AMH受体主要有2类受体，抗苗勒管激素受体Ⅰ(AMHRⅠ)和抗苗勒管激素受体Ⅱ(AMHRⅡ)，AMH受体在子宫、卵巢等苗勒管起源的组织器官中呈现高水平表达。AMH主要通过自分泌和旁分泌，主要通过结合Ⅱ型受体发挥生物学作用。AMH浓度含量呈现特征性变化，在女性出生时浓度含量较低，之后含量逐渐升高，达到青春期后呈现一个平台期持续到25岁，之后含量逐渐下降。目前研究的AMH临床应用较多。精浆中AMH浓度与精子的活力有一定的相关性，可作为男性不育的一个辅助检测指标，为不孕症的治疗提供一个更加有效的方法。AMH可预测卵巢的储备能力，能够预测了解女性的生育功能，预测女性的绝经年龄。AMH在多囊卵巢综合征患者中呈现高水平表达，在卵巢早衰患者中呈现低水平表达，可作为其诊断的一个辅助指标。

近年来，更多的研究着重在AMH与妇科肿瘤之间的关系。在女性妇科肿瘤中可以检测到AMHR的存在，研究表明AMH与卵巢颗粒细胞瘤的相关性最强。Dogan等[12]研究结果表明血清中AMH浓度在子宫内膜癌患者和对照组中无明显差异，与肿瘤的分期和组织学类型无关，而在肿瘤发生侵袭转移后，AMH水平呈现增高。AMH在上皮性卵巢癌中研究表明AMH与上皮性卵巢癌也有一定的相关性。有研究表明，AMH在子宫内膜异位症中能够抑制细胞周期和抑制细胞凋亡[13]。Stephen等[14]研究表明短时间内(1～3周)经肠外给予高纯度的重组人AMH药对卵巢癌有一定的抑制性作用，为AMH可作为卵巢癌的肠外治疗药物提供了有力的临床实验证据。Pieretti-Vanmarcke等[15]研究结果表明检测 rhAMH 对转基因卵巢癌小鼠模型及从其腹水中 提取的 AMHRⅡ阳性细胞系的作用，再次验证了重组人 AMH体内外对卵巢癌细胞有一定的抑制作用，同时治疗周期长达20周，证明了重组人AMH 的相对无害性和安全性。Zhang等[16]用重组人AMH处理培养人上皮性卵巢癌细胞系 OVCAR3和 OVCAR8，研究结果表明重组人AMH 能够通过阻滞细胞周期G1/S期抑制其卵巢癌细胞的增殖，通过减少肿瘤干细胞因子的分泌诱导卵巢癌细胞的凋亡。肖兰等[17]研究表明用重组人抗苗勒管激素干预卵巢癌细胞株OVCAR8和OVCAR3，能够抑制表达AMHR的卵巢癌细胞的增殖，促进其细胞凋亡。

本研究通过构建细胞创伤模型检测重组人AMH对卵巢癌细胞的迁移能力的影响。把AMH作为一种新的卵巢癌治疗的靶点治疗方法研究，其优点表现在：AMH受体在体内表达较少，相对副作用较小；一些患者呈现对化疗药物的耐药，如果给予AMH治疗，可能达到较好的效果。人体内本身就存在一定量的AMH物质，给予其AMH治疗，相对本身来说不属于外源物质，不良反应相对较少。本研究迁移能力试验结果显示，观察组细胞在48h细胞划痕的愈合程度低于阴性对照组细胞，表明观察组细胞的迁移能力明显低于对照组细胞。本文研究通过构建Transwell小室侵袭模型检测重组人AMH对卵巢癌细胞的侵袭能力，结果显示观察组穿过膜的细胞数明显低于对照组。计算其相对侵袭指数，观察组细胞和对照组细胞结果有显著差异，表明重组人AMH能够抑制卵巢癌细胞的迁移和侵袭，为卵巢癌的临床治疗和预后提供一个理论依据和一个新思路，AMH在卵巢癌治疗方面有着较好的应用前景，但是具体的调控机制有待进一步的研究。