紫檀芪调节PI3K/Akt/mTOR信号通路保护心肌缺血再灌注损伤大鼠的作用机制研究

付华君，孟 娟，宋文英，蒋延安，杨 瑞

当前，随着人们生活水平的提高及人口老龄化社会的到来，心脑血管相关疾病发病率也逐年升高，已成为严重危害健康的一类疾病，以冠心病为例，2020年我国冠心病病人超过1 100万例，严重影响老年人的生活质量[1-2]。急性心肌梗死为冠心病最常见的死亡原因，冠状动脉硬化斑块破裂后形成血栓并阻塞血管，在一定时间内血流再次恢复供应，造成心肌损伤进行性加重，这一过程称为心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia reperfusion injury，MI/RI)[3]。本病发生机制较为复杂，涉及氧化应激、自由基异常、线粒体损伤、细胞自噬、细胞凋亡和坏死、炎症刺激等[4-5]。磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路是重要的信号通路之一。研究报道，以PI3K/Akt/mTOR信号通路为评价指标，可能对心肌缺血再灌注损伤康复研究具有积极的意义[6]。本研究构建心肌缺血再灌注损伤动物模型，拟从PI3K/Akt/mTOR信号通路研究紫檀芪的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级SD大鼠72只，雌雄各半，购于西安交通大学医学院动物实验中心，体质量160～180 g，动物合格证号：SCXK(陕)2014-002。购买后饲养于西安交通大学动物实验中心。

1.2 药品及试剂 紫檀芪购于萨恩化学技术(上海)有限公司(货号：A01E1003520050)；阿司匹林注射液购于哈药集团生物工程有限公司(批号H20084565)；肌酸激酶同工酶(CK-MB)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)及乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒均购于武汉华美生物工程有限公司(货号分别为：CSB-E14403r，CSB-E13023r和CSB-E11324r)；炎性因子白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)试剂盒均购于武汉博士德生物工程有限公司(批号分别为：EK0393，EK1742和EK0526)；相关一抗包括PI3K、Akt、mTOR、磷酸化磷脂酰肌醇3激酶(p-PI3K)、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)、磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶体蛋白(p-mTOR)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)抗体均购于美国cell signaling technology公司(货号分别为：4249S，9272S，15006S，4288s，9611S，5536S和5174S)；二抗购于北京中杉金桥生物技术有限公司(货号：TA09)；牛血清蛋白、总蛋白提取试剂盒购于Sigma-Aldrich公司(货号分别为：V900933和TP0100)。

1.3 实验仪器 彩色多普勒超声便携机(BLS-X3型，武汉医盾医疗器械有限公司生产)；酶标仪(DNM-9606型，南京普朗医疗设备有限公司生产)；低温高速离心机[Sorvall Legend Micro 17型，赛默飞世尔科技(中国)有限公司生产]；分析级天平[EX225ZH/AD型，奥豪斯仪器(上海)有限公司生产]；电泳槽(Mini Pro3型，美国伯乐生命医学产品公司生产)，电泳仪(Bio-Rad Mini型，美国伯乐生命医学产品公司生产)。

1.4 实验分组与给药 按照随机数字法将SD大鼠分为假手术组、心肌缺血再灌注损伤组(MI/RI组)、紫檀芪低剂量组、紫檀芪中剂量组、紫檀芪高剂量组和阿司匹林组，每组12只。假手术组和MI/RI组给予10 mL/kg生理盐水灌胃，紫檀芪低剂量组、紫檀芪中剂量组、紫檀芪高剂量组分别给予紫檀芪10 mg/kg、20 mg/kg和40 mg/kg灌胃，阿司匹林组则给予30 mg/kg阿司匹林灌胃，每日1次，连续灌胃2周。

1.5 MI/RI模型的构建 各组大鼠均于末次给药1 h后分批次构建MI/RI动物模型。采用异氟醚将大鼠麻醉后固定于手术台上，胸部皮肤消毒后，于左侧第3肋和第4肋骨间进行开胸手术，开胸后暴露心脏，找到冠状动脉后进行穿线，除假手术组不结扎外，其余5组均进行结扎手术，结扎时间为30 min，30 min后恢复结扎线给予再灌注2 h即可，完成后按照流程处置动物、收集样本。

1.6 检测指标

1.6.1 心功能检测 所有大鼠均于再灌注2 h后采用多普勒超声仪检测左心室收缩末期内径(LVESD)、左心室舒张末期内径(LVEDD)、左室短轴缩短率(LVFS)和左室射血分数(LVEF)，评价结果为检测3次的平均值。

1.6.2 心肌梗死面积测定[7]处死大鼠后快速取出心脏组织，用4 ℃生理盐水充分洗涤心腔内血液后置入-20 ℃冰箱冷冻25 min。上述完成后用切片刀沿结扎线与房室沟的平行方向横切成5 片，每片厚约2 mm，用1%氯代三苯基四氮唑(TTC)溶液于37 ℃染色15 min，完成后用10%的甲醛溶液固定，取出后即可看到正常心肌组织为红色，而梗死区的心肌组织为白色，将其进行拍照，完成后采用Image J计算心肌梗死面积，梗死面积为缺血区域的面积占左心室的面积百分比。

1.6.3 血清指标测定 建模成功后2 h，抽取腹主动脉血3～7 mL(取血中尽量保证多抽取，根据统计最少为3 mL，最多为7 mL)，4 000 r/min离心5 min后提取上清液，按照试剂盒说明书检测CK-MB、AST、LDH、IL-1β、IL-6和TNF-α含量。

1.6.4 心肌组织形态学观察 称取部分心肌组织，置于4%的多聚甲醛溶液中固定24～72 h后，分批次进行苏木精-伊红(HE)染色完成后封片，采用带有照相功能的普通光学显微镜观察采集图像。每张切片选取4个不同的视野。

1.6.5 蛋白表达检测 称取部分心肌组织，采用Sigma-Aldrich总蛋白提取试剂盒提取总RNA，采用二喹啉甲酸(BCA)进行定量后调平，然后每组各取50 μg行SDS-PAGE凝胶电泳，电泳完成后将其转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，牛血清蛋白封闭2 h后，一抗过夜孵育，次日取出加入二抗孵育30 min，暗室曝光洗片，采用灰度值/GAPDH的灰度值检测p-PI3K、p-Akt和p-mTOR蛋白值。

2 结 果

2.1 各组心功能指标比较 与假手术组比较，MI/RI 组大鼠心脏LVESD和LVEDD值明显升高，LVEF和LVFS值明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)，与假手术组比较，紫檀芪低剂量组、紫檀芪中剂量组、紫檀芪高剂量组和阿司匹林组LVESD值明显升高，LVEF和LVFS值明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；与 MI/RI 组比较，紫檀芪低剂量组、紫檀芪中剂量组、紫檀芪高剂量组和阿司匹林组LVESD明显降低，LVFS和LVEF值明显升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表1。

表1 各组大鼠心功能指标比较(±s)

2.2 各组心肌梗死面积及心肌酶比较 与假手术组比较，MI/RI组、紫檀芪低剂量组、紫檀芪中剂量组、紫檀芪高剂量组和阿司匹林组心肌梗死面积、CK-MB、LDH和AST均明显增加，差异均有统计学意义(P<0.05)；与MI/RI组比较，紫檀芪低剂量组、紫檀芪中剂量组、紫檀芪高剂量组和阿司匹林组心肌梗死面积、CK-MB、LDH、AST均明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表2。

表2 各组心肌梗死面积及心肌酶含量比较(±s)

2.3 各组血清炎性因子含量比较 与假手术组比较，MI/RI组、紫檀芪低剂量组、紫檀芪中剂量组、紫檀芪高剂量组和阿司匹林组IL-1β、IL-6、TNF-α含量明显增加，差异均有统计学意义(P<0.05)；与MI/RI组比较，紫檀芪低剂量组、紫檀芪中剂量组、紫檀芪高剂量组和阿司匹林组IL-1β、IL-6、TNF-α含量均明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；紫檀芪中剂量和高剂量组IL-6、TNF-α含量均明显低于阿司匹林组，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表3。

表3 各组血清炎性因子含量比较(±s)单位：pg/mL

2.4 各组大鼠心肌组织病理学比较 假手术组心肌纤维排列整齐；MI/RI组可见明显的心肌断裂和出血，也可直接看到心肌损伤；与MI/RI组比较，紫檀芪低剂量组、紫檀芪中剂量组、紫檀芪高剂量组和阿司匹林组均有心肌纤维部分断裂，排列呈规则，明显好转，但仍没有假手术组心肌纤维排列整齐。详见图1。

图1 各组大鼠心肌组织HE染色结果(×400)

2.5 各组大鼠心肌组织 PI3K/Akt/mTOR 信号通路相关蛋白表达比较 与假手术组比较，MI/RI组、紫檀芪低剂量组、紫檀芪中剂量组、紫檀芪高剂量组和阿司匹林组p-PI3K、p-Akt和p-mTOR蛋白表达明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)，与MI/RI组比较，紫檀芪低剂量组、紫檀芪中剂量组、紫檀芪高剂量组和阿司匹林组p-PI3K、p-Akt和p-mTOR蛋白表达明显升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表4、图2。

表4 各组大鼠心肌组织PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白表达比较(±s)

图2 各组大鼠心肌组织中PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白表达电泳图(A为假手术组；B为MI/RI组；C为阿司匹林组；D为紫檀芪低剂量组；E为紫檀芪中剂量组；F为紫檀芪高剂量组)

3 讨 论

紫檀芪首先发现于紫檀，是紫檀中的主要药理活性成分之一，近年来研究发现，其在蓝莓和龙血竭中含量也较多，具有开发价值[8]。当前关于紫檀芪的研究较少，而关于与其结果相似的另一种中药单体白藜芦醇的研究较多[9]。研究发现，紫檀芪和白藜芦醇具有相似的药理活性，且紫檀芪的药理活性优于白藜芦醇，主要是因为紫檀芪的脂溶性较高，更易被人体吸收、利用[10-11]。已有研究将紫檀芪用于代谢性疾病及相关心脑血管疾病的治疗[12]。赵玮等[13]研究发现，紫檀芪对心肌缺血再灌注损伤具有明显的保护作用，并分析其作用机制可能与调节 Notch1 /eIF3a 信号通路，进而降低炎症反应有关。本研究构建心肌缺血再灌注损伤大鼠模型，观察紫檀芪对心肌缺血再灌注的作用，结果发现，紫檀芪预防给药能够升高LVFS 和 LVEF，降低LVESD值，提示紫檀芪对心脏功能具有保护作用；紫檀芪可有效降低缺血再灌注心肌梗死面积、改善心功能，进一步证明了紫檀芪对心肌缺血再灌注损伤的保护作用。

心肌缺血再灌注损伤与炎症刺激关系密切，在众多的炎症相关信号通路中，PI3K/Akt/mTOR 信号通路是经典的信号通路之一[7]，在PI3K/Akt/mTOR信号通路中，mTOR蛋白是其执行蛋白，mTOR属于一种非典型的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在执行功能时可以形成mTOR1(mTORC1)和mTOR2(mTORC2)两种类型，二者均可以有效调节细胞生长、调控蛋白质合成，同时抑制炎性因子过量表达等，而控制mTOR表达翻译和磷酸化的主要调控因子为PI3K/Akt 信号通路，PI3K/Akt信号通路也是与mTOR 关系最为密切的信号传导途径之一[14-15]。PI3K和Akt 蛋白多数情况下是生命活动所必需的，但是在受到相关外界因子的刺激后，可引起其结构发生磷酸化，这两种磷酸化的PI3K和Akt可直接激活 mTOR，诱导mTOR的磷酸化，mTOR在磷酸化后可破坏细胞的正常生理生化功能，导致炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α的过度产生，从而加速组织损害[16-17]。本研究结果也显示，与假手术组比较，各组大鼠血清炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α明显升高，p-PI3K、p-Akt和p-mTOR明显降低，而紫檀芪则可明显升高p-PI3K、p-Akt和p-mTOR蛋白的表达，同时降低IL-1β、IL-6、TNF-α的表达，进一步证实紫檀芪对心肌缺血再灌注损伤大鼠炎性因子具有明显的调节作用，其作用机制可能与紫檀芪调节PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白的磷酸化有关。

综上所述，本研究结果表明，紫檀芪对心肌缺血再灌注损伤大鼠具有明显的保护作用，可以减少心肌梗死面积，提高心功能指标，其作用机制可能与紫檀芪可以升高PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白的磷酸化，进而降低炎症反应有关。