去脂软肝方对非酒精性脂肪性肝炎大鼠FXR-FGF19通路的影响

夏恩蕊， 田格格， 张素妍， 张顺贞

云南中医药大学 中药学院， 昆明 650000

非酒精性脂肪性肝炎(NASH)是非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)中的炎症亚型，随着肥胖及其他代谢疾病的发病率增加，NASH的患病人数也逐步攀升[1]。已有研究[2]表明，对法尼醇X受体(FXR)进行调节，可使NASH得到不同程度的改善。在FXR-成纤维细胞因子19(FGF19)通路中，肠道FXR激活上调FGF19，FGF19随门静脉循环系统与肝细胞FGF受体4(FGFR4)结合，进而抑制胆汁酸合成酶CYP7A1，降低胆汁酸表达[3-4]，减少机体对脂质的吸收。去脂软肝方在临床治疗NASH方面取得了较好疗效[5]，本实验旨在探讨去脂软肝方对NASH大鼠FXR-FGF19通路的影响，为临床治疗NASH提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器 雄性SD大鼠(180～220 g)44只购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，生产许可证号: SCXK(湘)2019-0004，实验单位使用许可证号: SYXK(滇)K2013-0002。去脂软肝方(兰花参、莪术、白术、山楂、菊花、三七、青皮)；辛伐他汀片(Merck Sharp & Dohme BV，RO13440)。高脂饲料(82.5%普通饲料、10%猪油、2%胆固醇、0.5%胆酸钠、5%蛋黄粉)[6]。普通饲料购自楚商生物有限公司。IL-18、IL-1β、FGF19、胆汁酸(BA)试剂盒(江苏酶免，MM-20263R1)。FXR抗体(Affinity，DF12511)、CYP7A1抗体(Affinity，DF2612)。显微镜(德国ZEISS)、HE染色套装(Phygene，20200706)、饱和油红O(索莱宝，20200824)。ltrapure RNA Kit RNA提取试剂盒(康为世纪，CW0581S)；HiFiScript cDNA Synthesis Kit(康为世纪，CW2569M)；UltraSYBR Mixture(康为世纪，CW0957M)。垂直板电泳装置(TanonVE-180P RE)、垂直板电泳胶转膜仪装置(Tanon VE-586)、荧光定量PCR仪(Heal Force，CG)。

1.2 方法

1.2.1 动物造模、分组及给药 44只雄性SD大鼠适应性喂养1周后，随机分为正常组(Control组，n=8)、模型组(HFD组，n=12)、辛伐他汀组(Simvastatin组，n=8)、去脂软肝方高剂量组(QH组，n=8)、去脂软肝方低剂量组(QL组，n=8)，Control组给与普通饲料喂养，其余组高脂饲料喂养。HFD组分别于4周末、8周末取2只大鼠验模，其余10周末取材。Control组、HFD组以生理盐水(2 mL/d)灌胃，Simvastatin组以辛伐他汀灌胃(给药剂量为1.8 mg/kg)；QH组、QL组以去脂软肝方药液按生药量灌胃，给药剂量分别为27.72 g·kg-1·d-1、13.86 g·kg-1·d-1。

1.2.2 样本处理 10周末收集大鼠肝脏、血清、小肠。肝大叶用4%多聚甲醛固定常温保存，其余肝组织分装5份于2 mL离心管中。小肠取10 cm于4%多聚甲醛中固定，其余分装5份于2 mL离心管中。所有样品(4%多聚甲醛固定除外)保存于-80 ℃冰箱。

1.2.3 生化指标检测 采用全自动血清生化仪，检测大鼠血清中ALT、AST、TC、TG、HDL-C、LDL-C。

1.2.4 病理切片HE染色、油红O染色 取4%多聚甲醛固定后的10周大鼠肝脏，常规制备肝组织石蜡切片，进行HE染色，镜检。取相同周次样本，常规操作制备冰冻切片，油红O染色后封片，镜检。使用Image-Pro Plus 6.0软件统计油红O切片橘红色阳性区域累计光密度(IOD)与所选区域总面积(Area)，计算阳性率(IOD/Area)。

1.2.5 ELISA试剂盒检测 根据试剂盒说明书，检测8周大鼠肝脏、小肠中FGF19，以及肝脏中BA。

1.2.6 qRT-PCR 按试剂盒步骤提取RNA，测定浓度和纯度。利用Primer 3软件设计引物序列，由华大基因合成，以RT-PCR方法检测小肠中FXR mRNA、肝脏中CYP7A1 mRNA。通过2-ΔΔCt法计算相对表达量。

1.2.7 免疫组化法 肝脏切片进行常规脱蜡复水、抗原修复、过氧化物酶结合、抗原封闭。滴加一抗4 ℃孵育过夜，37 ℃复温30 min，PBS冲洗；滴加二抗，37 ℃孵育20 min，PBS冲洗。DAB显色5 min，PBS冲洗，苏木精复染5 min，盐酸酒精分化1～3 s，自来水冲洗10 min，常规脱水，透明，封片，镜检。观察大鼠小肠中FXR、肝脏中CYP7A1表达情况。免疫组化结果使用Image-Pro Plus 6.0软件统计棕色阳性区域累计光密度(IOD)与所选区域总面积(Area)，计算阳性率(IOD/Area)。

2 结果

2.1 肝脏病理变化 Control组大鼠肝细胞形态规则且排列有序，细胞核边缘清晰；HFD组肝细胞呈现大量脂肪空泡及气球样变，细胞排列紊乱，伴随肝细胞水肿和炎性渗出。与HFD组相比，各用药组脂肪变性情况改善，脂肪空泡减少，无明显炎性渗出，细胞形态较规则，肝索较为清晰。

Control组肝组织油红O染色切片细胞核清晰，大部分为蓝紫色，少见脂滴；HFD组出现大面积橘红色脂滴，数量较多，细胞形态不规则，呈现明显脂肪变性。与HFD组相比，各用药组橘红色脂滴阳性率均减少，其中QH组效果较为明显(图1、表1)。

表1 大鼠肝脏油红O切片阳性率比较

图1 肝脏病理切片(×400)

2.2 血脂和肝功能指标变化 与Control组相比，HFD组大鼠HDL-C显著下降，ALT、AST、TC、TG、LDL-C均显著上升(P值均<0.05)。与HFD组相比，各用药组的HDL-C显著升高，ALT、AST、TC、TG、LDL-C均显著下降(P值均<0.05)(表2)。

表2 大鼠血脂、血清肝功能指标比较

2.3 FXR-FGF19通路相关指标变化

2.3.1 ELISA检测结果 与Control组相比，HFD组大鼠小肠FGF19显著下降(P<0.05)、肝脏BA显著升高(P<0.05)。与HFD组相比，各用药组的小肠中FGF19显著升高(P值均<0.05)，肝脏BA显著下降(P<0.05)。HFD组大鼠与Control组相比肝脏FGF19有下降趋势，各用药组与HFD组相比肝脏FGF19有升高趋势，其中Simvastatin组呈现显著升高(P<0.05)(表3)。

表3 大鼠肝脏、小肠中FGF19和肝脏中BA水平比较

2.3.2 qRT-PCR检测结果 与Control组相比，HFD组大鼠FXR mRNA显著下降(P<0.05)，CYP7A1 mRNA显著升高(P<0.05)。与HFD组相比，QH组FXR mRNA显著升高(P<0.05)，QL组显著降低(P<0.05)，QH组CYP7A1 mRNA显著下降(P<0.05)(表4)。

表4 大鼠小肠FXR mRNA、肝脏CYP7A1 mRNA相对表达量比较

2.3.3 免疫组化检测结果 与Control组相比，HFD组大鼠FXR阳性率显著下降(P<0.05)，CYP7A1阳性率显著上升(P<0.05)。与HFD组相比，Simvastatin组、QH组FXR阳性率显著升高(P值均<0.05)，Simvastatin组、QH组、QL组CYP7A1阳性率显著下降(P值均<0.05)(表5、图2)。

表5 小肠FXR、肝脏CYP7A1阳性率

图2 大鼠免疫组化切片(×400)

3 讨论

脂质在肝脏中过度沉积，是NASH的主要成因之一，在NASH状态下机体常出现异常升高的BA[3]，BA进一步促进肠道对脂质的摄取，加速脂肪在肝脏的堆积。FXR-FGF19通路抑制BA合成不仅能减少机体对脂质的吸收，也能减少过度产生的BA对肝脏的刺激，减轻炎症反应[7-8]。

在正常状态下，BA的合成与负反馈调控共同维持其稳态，但在NASH的病理状态下FXR-FGF19通路受到抑制，无法正常发挥BA的调节功能[9-11]。本实验中，NASH模型大鼠出现了显著的BA合成量增加(P<0.05)，可能与病理状态下FXR-FGF19通路抑制有关。去脂软肝方干预后，FXR-FGF19通路重新激活，小肠FXR、肝脏FGF19上升，肝脏BA得到了显著的抑制(P<0.05)，且肝组织病理切片的脂质沉积有所改善，提示去脂软肝方可能具有调节FXR-FGF19通路的功能，并可能通过该途径减少脂质吸收，改善NASH脂质沉积。

去脂软肝方由云南省肝病专家、荣誉名中医苏涟教授拟方，临床疗效较好，课题组研究发现，去脂软肝方能改善高脂诱导脂肪肝大鼠血脂、肝脂及肝组织脂肪变性[12]，以及血液流变学相关指标[13]，减少肝组织血管性血友病因子(vWF)分泌，抑制血小板聚集[14]，并通过调节Oatp2b1等有机离子转运肽在不同器官的表达来改善NAFLD病变程度[15]，且对NLRP3炎症小体合成有抑制作用[16]。现代研究表明，方中白术[17]、山楂[18]、菊花[19]皆有保肝作用；青皮含有右旋柠檬烯，橙皮苷等有效成分，具有抗休克、抑制胃肠平滑肌收缩等作用[20]；三七中含有丰富的皂苷类、黄酮类等化学成分，具有预防心脑血管系统疾病、抗肿瘤、调节新陈代谢和生理功能、保护机体肝肾功能等作用[21]。

本研究采用高脂饮食建立NASH模型，发现去脂软肝方对FXR-FGF19通路有激活作用，这可能是该方发挥降脂作用的机制之一。 FXR在肠、肝、肾均有分布，通路复杂，且与糖脂代谢密切相关，本研究只初步探索了去脂软肝方对FXR-FGF19通路的影响，而该方对其他FXR相关通路的影响还有待研究。

伦理学声明：本研究方案于2020年6月1日经由云南中医药大学实验动物伦理委员会审批，批号:R-06202016，符合实验室动物管理与使用准则。

利益冲突声明：本研究不存在研究者、伦理委员会成员、受试者监护人以及与公开研究成果有关的利益冲突。

作者贡献声明：夏恩蕊负责课题设计，资料分析，撰写论文；夏恩蕊、张素妍、田格格参与动物造模及实验，修改论文；张顺贞负责实验设计拟定写作思路，指导撰写文章并最后定稿。