基于噬菌体的电化学生物传感器在检测食源性病原菌中的研究进展

王 吉，李慧慧，朱文娟，王 佳，王小红,*

（1.华中农业大学食品科学技术学院，湖北 武汉 430070；2.华中农业大学理学院，湖北 武汉 430070）

在全世界范围内食源性疾病一直是严重的公共卫生问题[1]。食源性疾病最常见的临床症状表现为胃肠道疾病，其中腹泻疾病最为严重。腹泻通常是由于食用了被食源性病原菌（如沙门氏菌（Salmonella）、大肠埃希菌（Escherichia coli）、副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus））等污染的食物引起的[2]。据世界卫生组织（World Health Organization，WHO）2015年的数据统计，全球每年约有5.5亿 人患病和23万 人死亡，且病例广泛分布在世界各个国家，无论是发达国家还是中等和低收入国家都有一定数量的食源性疾病暴发[3]。到目前为止，食源性病原菌的快速检测依旧是研究的热点，除了传统的微生物学培养方法和生理生化鉴定外，其他的检测方法也不断被开发，例如免疫学方法[4-5]（酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法、免疫层析试纸法等）、分子生物学方法[6-7]（聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）、多重PCR技术、基因芯片等）、生物传感器等，这些技术虽然在一定程度上解决了传统方法耗时费力的问题，但依旧或多或少存在着一些不足之处。

生物传感器是由生物感受器（识别元件）、换能器及信号放大装置构成的一种分析检测工具[8]。根据识别元件的不同可以分为酶传感器、抗体传感器、细胞传感器、DNA、适配体传感器等；识别元件是生物传感器的关键部件。根据换能器类型不同可分为热学生物传感器、光学生物传感器、电化学生物传感器等。电化学生物传感器的基本原理是生物识别元件捕获目标分析物后，在电极界面上进行电化学反应从而引起传感器表面的电流、电位、阻抗等电信号的变化，根据监测到的电信号的变化来定量目标分析物的浓度[9]。近年来，伴随着新型生物识别元件噬菌体的介入以及高灵敏度电化学分析仪等有效手段的开发，利用电化学生物传感器检测食源性病原菌技术得到了极大的发展[10-19]。与酶、抗体、核酸等识别元件相比，新型识别元件噬菌体由于其稳定性高且对细菌的特异性强而越来越多地被应用到电化学生物传感器中[20-22]。

噬菌体是一种能够特异性吸附感染细菌的病毒，广泛存在于地球上，其种类繁多、数量庞大。噬菌体是专性活细胞内寄生物，具有不同的生命周期，可分为烈性噬菌体和温和噬菌体两类[23]。烈性噬菌体是其核酸侵入宿主细胞后短时间内就引起宿主细胞裂解的一类噬菌体；温和噬菌体是其核酸侵入宿主细胞后，核酸附着并整合在宿主染色体上，随宿主细胞的核酸同步复制，短时间内不引起宿主细胞裂解但抑制其生长的一类噬菌体[24]。基于这一特性，目前已经有多种噬菌体被直接应用到食源性病原菌的防控中[25-28]，如由美国Intralytix公司开发的ShigaShield噬菌体制剂被应用于食源性/水源性志贺菌污染的控制[25]；由荷兰Micreos公司研制的Salmonelex噬菌体鸡尾酒制剂被应用于肉类和禽类产品中沙门菌污染的控制等[26]。噬菌体除了被应用到病原菌的防控上，也被用于病原菌的检测中。噬菌体被用作电化学传感器的识别元件主要是由于它具有以下的特性：第一，噬菌体粒子在纳米范围内具有明确的几何形状和尺寸[29]，在适当的缓冲液中它们被认为是单分散的纳米粒子；第二，噬菌体表面有广泛被修饰的可能性，噬菌体可以通过基因工程在其表面展示外源肽[30-31]，也可以通过化学修饰在其表面获得新的官能团，这些修饰赋予噬菌体粒子新的特性，使其能与所需的目标分析物结合；第三，噬菌体在自然界种类多、数量大[32-33]，几乎能设计出对每种细菌都有特异性的生物传感器。基于这些特点，研究者对利用噬菌体修饰的电化学生物传感器产生了浓厚的兴趣。因此，本文着重综述了噬菌体应用于电化学生物传感器中的两个主要方面：1）噬菌体在电极表面的固定化方法；2）基于噬菌体作为识别元件的电化学传感器检测食源性病原菌的研究现状及发展趋势。

1 噬菌体在电极表面的固定方法

基于噬菌体的电化学生物传感器首先需要将噬菌体颗粒牢固地固定在传感器表面上，这样它们才能作为目标的识别元件而发挥作用。但这样的传感器用于检测还需要满足几个条件，首先，固定的噬菌体必须保持其活性，即具有特异性识别细菌细胞的能力，尽管噬菌体比抗体更能抵抗恶劣的环境，但它们依然会由于环境干燥或生存条件的快速变化而失活；其次，噬菌体在传感器表面的大量吸附和均匀分布是获得高灵敏度生物传感器的重要保障，同时也应考虑噬菌体受体的可用性，特别是以形状不规则有尾噬菌体作为识别元件情况下的可用性；最后，保证噬菌体不从电极表面解离到分析液中也是至关重要的。目前，已经有文献报道了如何将噬菌体固定在传感器表面的方法，常用的固定化方法包括噬菌体粒子在基质表面的物理吸附、共价结合、利用特定的相互作用（例如生物素-亲和素、静电相互作用）以及噬菌体粒子被截留到导电聚合物基质中等。

1.1 物理吸附

随机物理吸附是将生物分子固定在固体基质上最简单、最快捷的方法。因为物理吸附不需要对生物组分进行预活化、化学修饰或利用交联剂，也不依赖多步骤和长时间的实验过程。因此，在生物分子固定研究中经常被使用。

Mejri等[34]采用了物理吸附法将噬菌体颗粒固定在金电极上。该研究首先制备了交叉指状金电极，之后进行超声清洗，以确保电极表面洁净，随后直接滴涂上T4噬菌体溶液，并在37 ℃潮湿的环境中孵育90 min，以防止噬菌体溶液蒸发。随后用无菌磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）彻底洗涤，并用牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）溶液封阻，最后借助电化学阻抗生物传感器检测大肠杆菌。利用简单的物理吸附固定噬菌体不仅可被应用于电化学生物传感器，在其他类型的生物传感平台中也可以被使用。例如，Olsen等[35]使用凭借噬菌体展示技术获得的丝状噬菌体颗粒作为识别元件，通过物理吸附将其固定在磁弹性传感器表面。一些研究利用磁弹性传感器进行检测也获得了成功[36-41]。此外，Balasubramanian等[42]利用能特异性裂解金黄色葡萄球菌ATCC 12600的噬菌体为识别元件，也通过物理吸附的方式将其固定在以表面等离子体共振（surface plasmon resonance，SPR）为检测平台的金传感器表面。

用物理吸附法固定噬菌体快速简便，避免了耗时复杂的化学改性过程。然而，由于液体的剪切力等因素，物理吸附的噬菌体往往会从载体表面脱落。因此，有必要对制作的传感器在测定条件下的稳定性进行验证。在制作了基于噬菌体的电化学生物传感器后，Mejri等[34]对电极的稳定性进行了探究，结果表明，在T4噬菌体物理吸附至金表面的情况下，阻抗信号至少可以在5 h内保持稳定。然而，通过物理吸附固定的噬菌体在传感器表面的定向是随机的，这将导致许多已经吸附上的噬菌体不能用于分析。Richter等[43]提出了噬菌体在电极表面的准确定向方法，其利用静电场效应，使噬菌体的头部附着在金表面，尾纤蛋白被释放，从而增加了金表面有效噬菌体的数量。这种处理被认为是可行的，因为有尾噬菌体的头部包含带负电荷的DNA，尾部有带正电荷的尾纤蛋白[44]。与随机吸附的噬菌体相比，固定同样数量的噬菌体颗粒，在有电场的条件下，传感器表面捕获的细菌数量增加了4 倍。

1.2 共价键合

噬菌体与电极表面发生化学反应，通过共价键而固定下来。该方法固定的噬菌体比物理吸附固定的噬菌体更加稳定，在相同的环境下提供了更有力的结合，而且在测定过程中噬菌体从固定表面分离的机会也更少。因此，在电化学生物传感器中更常用这种固定化方法[45]，并已开发出多种不同的化学键合方式。

Jia Yunfang等[46]创建了一种使用戊二醛作为连接剂将噬菌体共价固定在传感器表面的方法。他们在电位传感器的氮化硅层上附着一层(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷（aminopropyltriethoxysilane，APTES），以获得氨基表面，然后加入戊二醛，在醛和伯胺之间形成共价键，M13噬菌体以同样的方式与戊二醛的另一个醛基共价连接，从而形成稳定的噬菌体层。Handa等[47]也利用醛和伯胺的反应将噬菌体P22固定在(3-氨基丙基)三甲基硅烷（3-aminopropyltrimethoxysilane，APTMS）修饰的玻璃衬底上。Shabani等[48]也使用了类似的方法，首先在碳电极表面通过电化学还原4-硝基苯重氮离子而生成氨基团，然后用戊二醛处理电极，并浸入噬菌体γ溶液中。此外，Tlili等[49]提出了另一种胺-胺偶联技术，在金电极上覆盖半胱胺，以1,4-二硫氰酸酯作为交联剂，然后固定T4噬菌体。Sedki等[16]采用了另一种化学键合的方法固定噬菌体，在该研究中，玻碳电极表面通过电化学沉积上金纳米粒子，然后浸入3-巯基丙酸（3-mercaptopropionic acid，MPA）溶液中，通过巯基-金的自组装作用，在金纳米颗粒（Au nanoparticles，AuNPs）表面修饰上羧基，之后用1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（1-ethyl-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride，EDC）和N-羟基硫代琥珀酰亚胺钠盐（N-hydroxysulfosuccinimide sodium salt，NHS）活化羧基，M13噬菌体通过表面的氨基与活化羧基之间形成酰胺键而被固定下来（图1）。这种固定方法已经被广泛的使用，在Han Lei[50]、Narayanan[51]等的研究中也采用了类似的固定方法。

图1 噬菌体共价固定在金电极表面示意图[16]Fig. 1 Schematic diagram of phage covalently immobilized on the surface of gold electrode[16]

尽管通过共价键合的方法固定噬菌体大多数需要昂贵试剂和多步骤处理，但因为它们能够提供稳定和致密的噬菌体层，所以这种方法也经常得到使用。Singh等[52]比较了物理吸附法以及糖类、半胱氨酸和半胱胺修饰的金表面固定噬菌体的数量，且半胱氨酸、半胱胺组同时用体积分数2%戊二醛处理，结果发现用相同浓度的噬菌体去吸附，半胱胺+戊二醛修饰组固定的噬菌体量最多，比单纯物理吸附高37 倍，随后将经噬菌体修饰的金表面暴露于宿主大肠杆菌EC12中，通过荧光显微镜确认捕获大肠杆菌的数量，发现该方法捕获的菌量为（11.9±0.2）个/100 μm2，是物理吸附法捕获菌量的9 倍。

1.3 特定的相互作用

随着基因工程和分子生物学技术的日渐成熟，利用噬菌体展示技术获得的新型噬菌体也被广泛应用到电化学生物传感器中。生物素-亲和素是目前已知的强度最大的非共价作用复合物，其亲和常数可达到10～15 mol/L[53]，因此在噬菌体的固定化中也可利用生物素-亲和素之间的这种天然亲和力。在Gervais等[54]的研究中，其首先通过噬菌体展示技术获得修饰了生物素的T4噬菌体；然后将金电极浸入含有磺化氨磺酸链霉亲和素的溶液中以获得覆盖层；再将金电极和噬菌体悬液混合，噬菌体则通过生物素/链霉亲和素之间的亲和力被修饰到传感器表面。这种方法固定的噬菌体密度为4.4个/μm2，与物理吸附相比增加了15 倍。

另一种相互作用是静电吸引，噬菌体利用自身所带电荷与固体基质表面之间的静电力相互作用而固定下来。据报道，大多数病毒的净电荷为负[55-56]。Anany等[44]进一步研究发现T4噬菌体的头部Zeta电位为负，而尾部纤维电位为正，这意味着噬菌体可以被静电吸引到带电的固体基质表面。因此，Cademartiri等[57]基于静电相互作用将4种形态不同的噬菌体固定在改性的二氧化硅表面上，该研究用3种不同的试剂对二氧化硅表面进行了改性，将其表面电荷从带负电荷调正为带正电荷，结果发现，离子表面的存在增加了与二氧化硅颗粒结合的活性噬菌体数量，且阳离子表面有利于噬菌体的正确定向，即“头向下”和“尾巴向上”。在此基础上，Anany等[44]成功地将噬菌体固定在带正电荷的纤维素膜上，而且还发现固定在带正电荷膜上的噬菌体数量明显高于未改性膜上的噬菌体数量。Zhou Yan等[13]也采用静电相互作用将T2噬菌体固定在玻璃化的聚乙烯亚胺（polyethyleneimine，PEI）修饰的碳纳米管上。他们用相对于Ag/AgCl电极+0.5 V的电位施加在工作电极上，通过噬菌体与碳纳米管的静电吸引作用，实现了噬菌体颗粒在碳纳米管上的定向固定（图2）。

图2 噬菌体在玻璃化的聚乙烯亚胺修饰的碳纳米管上定向和固定化的示意图[13]Fig. 2 Schematic description of the charge-directed orientation and immobilization of bacteriophage onto polyethyleneimine-functionalized carbon nanotube (CNT) on electrode surface[13]

1.4 聚合物基质的截留

另一种固定噬菌体的方法是在电极表面形成一种噬菌体聚合物膜。例如Ionescu等[58]首先提出了将噬菌体和导电聚合物混合的方法。其用吡咯-烷基铵单体和能与西尼罗河病毒免疫球蛋白（immunoglobulins，Ig）G结合的T7噬菌体混合溶液修饰工作电极，然后控制电位进行电聚合，用该方法得到的噬菌体聚合物修饰电极可成功用于西尼罗河病毒IgG的检测。随后，其他研究人员也开展了一系列在导电聚合物基质中截留噬菌体的研究，总体思路是采用电聚合法制备掺有噬菌体的导电薄膜，例如将电极浸入含有支撑单体、噬菌体颗粒和高氯酸锂的溶液中，在电聚合过程中在电极表面上沉积一层薄膜[59-62]。经噬菌体-单体复合薄膜修饰的电极已经成功用于检测M13噬菌体特异性抗体[49]和前列腺特异性膜抗原[59]。Farooq等[10]在此基础上进行改进，将噬菌体截留在表面经修饰的细菌纤维素（bacterial cellulose，BC）基质中，研制了一种新型的电化学生物传感器。首先将羧化多壁碳纳米管（carboxylated multiwalled carbon nanotubes，c-MWCNTs）添加到细菌纤维素基体中以获得固体支持物（BC/c-MWCNTs），然后用聚乙烯亚胺对BC/c-MWCNTs进行表面修饰，使其表面带正电荷，随后将该复合物与噬菌体悬液混合6 h，噬菌体即被截留到复合材料中，并通过扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM）和傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）分析证实了BC/c-MWCNTs-PEI-Phages生物界面的形成，随后用该混合物作为电极，成功地检出大肠杆菌（图3）。

图3 噬菌体被截留于碳纳米管修饰的细胞纤维素中[10]Fig. 3 Phage entrapped in CNT-modified cellulose[10]

2 基于噬菌体的电化学生物传感器在检测致病菌中的应用

自Clark等[63]制备了世界上第一个公认的生物传感器后，生物传感器便开始进入研究者的视野。为了改善生物传感器的性能，一些元件被整合到其中。例如在识别元件中有酶、抗体、核酸[64]以及野生型或基因工程噬菌体[65-66]的加入。噬菌体与宿主细胞具有天然的亲和性，因此可用于细菌的捕获和检测。此外，基因工程改造的噬菌体和噬菌体展示技术的应用使噬菌体成为检测各种目标物更加理想的探针。另一方面，生物传感器的创新在于传感平台的不同，基于转导机制的不同可将生物传感器分为光学（包括光吸收/反射、荧光、发光和光纤）[67-69]、质量或质量敏感型（如石英晶体微量天平、磁弹性和悬臂）[70-72]以及电化学（包括测量电流、阻抗、电容和电导）等传感器。而近年来，电化学生物传感器的发展更加迅速，特别是利用电化学生物传感器检测食源性病原菌。电化学生物传感器被认为是最有效的检测食源性病原菌的方法之一，主要是因为其固有的优势（如坚固性、易于小型化、出色的检测限、低成本以及现场测试的可能性等）。在电化学生物传感器中，目标分析物与传感器的结合将导致电极界面电化学特性的变化，并产生可测量的信号，如电阻、电流、电势等。

2.1 基于噬菌体的阻抗传感器

目前大多数基于噬菌体的电化学传感器都使用电化学阻抗谱（electrochemical impedance spectroscopy，EIS）作为检测技术。EIS可测定由于固定在工作电极表面上的噬菌体因捕获或裂解靶细菌细胞而引起的阻抗变化。

Tlili等[49]提出了一种无标记的阻抗型生物传感器。其将半胱胺修饰在金表面上从而共价固定T4噬菌体，用EIS检测E. coliB，利用[Fe(CN)6]3－/[Fe(CN)6]4－作为氧化还原探针，对不同浓度的细菌（103～109CFU/mL）进行了阻抗测定。随着检测细菌浓度的增加，可以观察到电荷转移电阻（Rct）明显增加，这可以归因于细菌细胞与固定的T4噬菌体结合而导致电极表面氧化还原反应位点的封闭。该方法可在15 min内完成检测，检出限为8×102CFU/mL。细菌浓度变化引起阻抗增加的趋势也可以在其他研究工作中发现[16,73]。Moghtader等[73]开发了一种一次性铅笔状石墨电极（pencil graphite electrodes，PGE），该电极表面涂有金纳米棒（gold nanorods，GNRs），以增加界面电导率，从而提高检测灵敏度。该研究将对大肠杆菌K12具有特异性的T4噬菌体固定在修饰有金纳米棒的石墨电极上，采用[Fe(CN)6]3－/[Fe(CN)6]4－氧化还原探针测定电极表面的电阻，结果表明，阻抗会随着细菌浓度的增加而增加，在100 μL目标悬浮液中的检出限为102CFU/mL。Bhardwaj等[74]也开发了一种丝网印刷石墨烯电极来特异性检测致病菌Staphylococcus arlettae。其将能识别Staphylococcus arlettae的噬菌体通过化学键合法固定在石墨烯电极上，以含有5 mmol/L K3Fe(CN)6+K4Fe(CN)6·3H2O的PBS作为氧化还原探针测定电极表面电阻，结果显示，在菌浓度为2.0～2.0×106CFU/mL范围内线性趋势良好。Sedki等[16]也利用EIS检测大肠菌群，其将金纳米粒子沉积在玻碳电极表面，使用化学固定法将M13噬菌体粒子固定在上面。该生物传感器的检测限为14 CFU/mL，是迄今为止已经报道的基于噬菌体EIS中检测限最低的。EIS作为一种快速有效的监测电极界面微小变化工具，已经得到广泛的应用。

但是，一些研究人员在进行阻抗测定时发现，Rct与细菌浓度之间呈负相关[11,35,75]。Zhou Yan等[13]开发了一种基于T2噬菌体的碳纳米管传感器用于E. coliB的检测。该学者发现当细菌浓度增加时，Rct反而降低，这与之前的研究结果[16,49,73]相反。为了揭示这个现象，该学者借助细菌生存力试剂盒研究了噬菌体和细菌之间的相互作用，将噬菌体与宿主菌混合，大约20 min后，用荧光显微镜观察到活细菌细胞数量明显减少，表明此时E. coliB细胞已被T2噬菌体感染并溶解。因此，Rct的降低可能是噬菌体感染引起细胞裂解的结果，由于细胞的裂解，细胞内组分释放，这些组分通常是高度可移动的离子材料（例如K+和Na+），从而增加了电极表面附近介质的电导率，造成了电极阻抗的降低[34,59]。Mejri等[34]分别用附着有T4噬菌体和抗体涂层的指状微电极检测大肠E. coliK12，结果发现，与抗体涂层传感器相比，用噬菌体检测可以产生双重信号，这反映了捕获和裂解靶细菌细胞两个过程。除了对细菌浓度进行定量分析外，他们还对传感器的特异性进行研究，分别记录了在存在E.coliK12和乳酸杆菌的情况下随时间的延长阻抗的变化情况。结果表明，对于T4噬菌体的宿主细菌E. coliK12，检测到阻抗首先由于细菌细胞附着而增加，然后由于细菌细胞的裂解而降低，而乳酸杆菌没有明显的阻抗变化。双重信号的产生也有助于区分目标分析物与传感器表面的非特异性吸附或交叉结合。Shabani等[75]也提出了由细菌和噬菌体相互作用而所引起类似的时间依赖性阻抗响应。他们制备了一种T4噬菌体共价固定的丝网印刷碳电极（screen-printed carbon electrode，SPE）用于E. coliK12的检测，并使用EIS对50 μL样品进行阻抗检测，确定检测限为104CFU/mL。此后，Shabani等[48,76]还用噬菌体包被的磁珠浓缩样品中的靶细菌细胞来进一步提高其传感器的检测性能，将这些改性磁珠与细菌悬浮液混合，依靠噬菌体特异性捕获目标细菌，在测定过程中，添加磁场以将磁珠捕获的细菌细胞吸引到传感器表面。该研究通过磁分离步骤成功地将传感器灵敏度提高了一个数量级，对E. coliK12和炭疽芽孢杆菌的检出限都达到了103CFU/mL。

2.2 基于噬菌体的安培传感器

除了广泛使用的阻抗型检测技术外，基于噬菌体的安培检测技术也得到了研究。常用的检测技术有差分脉冲伏安（differential pulse voltammetry，DPV）法、循环伏安（cyclic voltammetry，CV）法等。在该检测技术中噬菌体多数情况下不被用作生物探针，而是用来感染并裂解溶液中的细菌，然后通过测定细胞裂解所释放内容物（酶等）的量来确定待检菌的数量。

DPV法通过优化充电电流来提高灵敏度、检测限和扩大线性范围。Wang Danhui等[15]开发了一种使用T7噬菌体检测大肠杆菌的方法。他们用编码β-半乳糖苷酶（beta-galactosidase，β-gal）的lacZ操纵子改造T7噬菌体，使其能够在感染和裂解大肠杆菌细胞的过程中触发β-gal的过表达并释放大量的酶生物标志物。随后以4-氨基苯基-β-吡喃半乳糖苷（4-aminophenyl-β-galactopyranoside，PAPG）为底物间接检测噬菌体诱导β-gal的量。通过安培检测技术监测与细菌浓度成正比的对氨基苯酚（p-aminophenol，PAP）产物的量。Wang Danhui等[15]在多种液体样品中进行测试，结果发现检测限会随着时间的延长而提高，3 h检测限可达105CFU/mL，7 h检测限可达102CFU/mL。Neufeld等[11]也提出了一种利用噬菌体感染和安培检测技术来检测大肠杆菌的方法。该研究中使用携带编码碱性磷酸酶报告基因的丝状噬菌体M13K07，在噬菌体感染增殖过程中报告基因被表达，报告酶被引导至外质膜和细胞壁之间的周质空间。由于细胞壁的多孔结构，底物对氨基苯基磷酸酯也可以顺利地进入周质空间，在酶的作用下生成对氨基苯酚产物，随即发生扩散并能够通过安培法进行测定，在3 h内检测限可达1 CFU/mL。此外，Yemini等[77]开发了一种基于噬菌体的丝网印刷电极检测B. anthracis和M. tuberculosis的方法，该学者用Bacillus cereus和Mycobacterium smegmatis作为B. anthracis和M. tuberculosis的模型进行研究。由于电极上固定的噬菌体捕获并裂解宿主菌，释放α-葡糖苷酶和β-葡糖苷酶，造成反应底物对氨基-苯基-α-D-葡糖吡喃糖苷（p-amino-phenyl-α-D-glucopyr-anoside，p-AP-α-GLU）和对氨基-苯基-β-二谷醇素（para-aminophenyl-β-D-glucopyranoside，p-AP-β-Glu）水解为PAP，对氨基苯酚在电极上被氧化从而引起电流的变化，该方法在8 h内检测限可达10 CFU/mL。

2.3 基于噬菌体的电容传感器

在电化学生物传感器中，当识别元件与目标分析物结合时，也会引起生物传感系统中电容的变化。电容检测的原理是基于金属电极表面的双电层，工作电极仅固定生物传感元件时，会具有稳定的双电层电容响应，而当目标分析物与电极表面上的生物传感元件结合时会导致电容减小[78]。Niyomdecha等[79]开发了一种电容式流动注射系统来检测沙门氏菌，其使用化学固定法将M13噬菌体修饰在聚酪胺/金电极表面上，首先将缓冲液以一定的流速注入流动注射系统以获得电极表面电容基线，然后在缓冲液中加入一定量沙门氏菌，以相同的条件注入检测系统中，这时电极上的噬菌体会和细菌之间产生结合，导致电极的电容发生改变，从而确定结合的沙门氏菌的量。该传感器具有良好的重复性和稳定性，在实验条件下能重复使用40多次，且在样品流速为75 μL/min时，其检测范围为2.0×102～1.0×107CFU/mL。这种生物传感器可以在动态体系中进行，有利于生物识别元件与目标分析物的结合，为利用噬菌体检测病原菌提供了新的思路。

3 结 语

基于噬菌体的电化学生物传感器因其高度的特异性、稳定性和简便等特点而受到极大的关注，同时，噬菌体展示技术的成熟也扩展了野生型噬菌体的应用范围，研究者可以利用噬菌体展示技术在噬菌体表面获得不同的肽或蛋白质，从而提供与更多目标分析物结合的可能性。近年来，已经研发出多种不同的固定方法将噬菌体修饰到传感器的表面，包括物理吸附、化学修饰、特定的相互作用和物理截留等。同时基于噬菌体天然偶极子性质的电沉积也愈发引起研究者的关注，因为它可以诱导噬菌体的准确定向，与随机吸附相比，在电荷辅助的条件下增加了有效噬菌体的固定数量。噬菌体作为电化学生物传感器的识别元件，在原料的获得上更加简便，噬菌体在自然环境中大量存在，与酶、抗体、核酸等相比，只需要通过简单的筛选步骤即可获得对某一细菌具有特异性的噬菌体；其次，噬菌体的耐受能力强，其对温度、pH值、有机试剂以及其他不良环境都有一定的耐受力。在研究过程中，将特异性强的噬菌体与简便快捷的电化学传感技术结合起来，制得的电化学生物传感器更加灵敏、准确，同时也极大提高了检测的效率。

尽管过去几年中基于噬菌体电化学传感器的研究已经取得了很大的进展，但在实际应用中仍然面临许多挑战。噬菌体作为活体生物材料用作识别元件时，一方面会由于环境干燥而失活，从而丧失与目标分析物结合的能力；另一方面，目前用于研究的噬菌体大多是温和的丝状噬菌体，而它们并不能够对所有的细菌都有吸附能力，其他类型的噬菌体虽然也有使用，但它们普遍具有裂解性，在研究中会造成双重信号的出现，影响检测结果的准确性。同时实际样品中也存在许多基质，会影响检测的灵敏度，制备的传感器在环境和食品样品检测中的可重复性和稳定性也仍需进一步验证。因此，基于噬菌体的电化学生物传感器在实际应用中还需要进一步的创新与发展。

随着对噬菌体研究的不断深入，人们发现噬菌体编码的蛋白（例如噬菌体编码的受体结合蛋白（receptor binding proteins，RBPs））往往比噬菌体颗粒更适合作为识别元件用于生物传感器中。RBPs是一类能将噬菌体结合到宿主细胞表面上的噬菌体结构蛋白的统称，包括尾纤蛋白、尾刺蛋白等。噬菌体之所以能够特异性地识别并感染细菌，其主要原因是这些RBPs能与宿主菌表面特异性位点作用。相较于抗体而言，RBPs具有更高的稳定性和特异性，例如对大多数抗体都无法有效识别的碳水化合物位点也具有一定的亲和力；相较于噬菌体颗粒而言，RBPs不具备裂解细菌的能力，因而制备的生物传感器更加持久稳定。近年来有研究发现，可以通过基因工程技术将不同受体蛋白结合域融合到噬菌体的RBPs上，从而扩大噬菌体的宿主范围，这些研究都将为基于噬菌体的电化学生物传感器的进一步发展奠定良好的基础。