低浓度乙烯利结合1-甲基环丙烯处理对香蕉果实香气合成的影响

朱孝扬，沈 玲，司振伟，侯选文，陈维信，陆旺金，李雪萍

（华南农业大学园艺学院，南方园艺产品保鲜教育部工程研究中心，广东省果蔬保鲜重点实验室，广东 广州 510642）

香蕉是世界上最重要的水果之一，是我国热带亚热带地区广泛种植的特色水果，也是我国华南地区出口和北运的主要水果之一[1-2]。香蕉果肉中富含淀粉、糖、蛋白质、果胶、VA、VB、VC、VE和钙、磷、铁等矿物质[1]，营养价值高。香蕉，顾名思义，怡人的香气是其显著的特点，也正是因为香蕉具有良好的风味品质，一直深受人们的喜爱。

香蕉是典型的呼吸跃变型水果，在贮运过程中，香蕉释放出大量的乙烯，出现呼吸高峰，内部组织发生一系列生理生化变化，具体表现为果皮由绿转黄、挥发性风味物质产生、果肉软化、含糖量增加、组织透性增加[3]。香蕉采收后，随着香蕉的成熟衰老，耐贮藏性不断下降，该特性严重制约了香蕉贮运保鲜，生产上香蕉在运销过程中损失严重，可高达20%～30%或更多，严重影响了香蕉产业的经济效益[4]。因此，研究延缓香蕉成熟衰老和延长货架寿命的方法有重要的意义。

香蕉果实特有的香气是其吸引消费者和增强市场竞争力的重要因素之一。随着国际市场对水果品质的要求越来越高以及食品工业对天然风味物质需求的增加，果品香气日益受到关注，已成为水果品质的重要研究领域之一[5-6]。果实的香气物质不但和果实品质有关，而且与果实的采后生理、贮藏加工以及微生物活动等方面有密切关系，其种类和含量是表征果实采后贮藏及货架寿命的重要指标之一[7-8]。影响果实香气物质含量和种类的因素很多，包括品种、种植方式和栽培区域、果实的采收成熟度和采后处理方式及贮藏方式等等[8-9]。目前已知香蕉果实的香气成分有230种以上，主要为酯类、醇类和羰化物等[10]。

1-甲基环丙烯（1-methylcyclopropene，1-MCP）作为一种安全无毒的乙烯受体抑制剂，可显著延缓果蔬的成熟衰老[11-12]，并已成功地在苹果、花卉等园艺产品商业贮藏保鲜中应用。但是香蕉对1-MCP处理较敏感，如果1-MCP处理方法不当，可影响香蕉成熟时果皮的正常转黄和抑制香蕉香气物质的生成[11,13]，因此限制了1-MCP在香蕉贮藏保鲜中的应用。经过1-MCP处理的香蕉果实醇类物质含量大量增加，而相应的酯类物质含量减少[13]，1-MCP对果实风味的影响主要是抑制其芳香物质的形成，减少果实的挥发性物质总量[14]。1-MCP处理显著抑制了粉蕉果实成熟过程中4种特征性酯类的生成，抑制了己醛与反-2-己烯醛的产生[7]。此外，1-MCP还会影响苹果、油桃、猕猴桃果实香气物质的形成[15-16]。高浓度1-MCP处理有效延缓了猕猴桃品质劣变，但是抑制了猕猴桃果味香气物质特别是酯类物质的形成[17]。1-MCP处理延缓桃果实成熟衰老的同时，也改变了桃果实香气物质代谢模式[18]。在蓝莓果实的研究中也发现，1-MCP处理会显著减少果实的香气物质形成，而1-MCP结合乙烯利处理能够消除1-MCP对香气物质的影响[19]。本课题组前期研究发现，短时间乙烯利处理后再用1-MCP结合处理，可以有效消除香蕉果实转色不均匀的后熟问题，也减轻了单独1-MCP对香气物质的抑制作用[11]，但其对香气合成影响的相关机理尚不明确。本研究进一步探讨1-MCP对香蕉果实香气代谢的影响，为生产上延长香蕉果实贮藏寿命、提高贮藏品质提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

供试香蕉‘巴西’蕉（Musaspp. cv. ‘Brazil’）（7.5～8成熟），采自广东省番禺市南沙区。

强力（二氧化氯清洗剂） 中国农业科学院中兽医研究所药厂；抑菌鲜（异菌脲） 江苏快达农化股份有限公司；辉风百克（咪鲜胺） 江苏辉丰生物农业股份有限公司；乙烯利 上海华谊集团华原化工有限公司；各标准品（色谱纯）及所有分离用有机溶剂均为国产分析纯，均购于上海生工生物工程技术服务有限公司；RNA LA PCRTM Kit (AMV) Ver 1.1、Agarose Gel DNA Purification Kit日本Takara公司；Invitrogen M-MLV逆转录酶试剂盒美国Thermo Fisher Scientific公司；SYBR Premix ExTaq II试剂盒 宝生物工程（大连）有限公司；乙醇脱氢酶（alcohol dehydrogenase，ADH）试剂盒 南京建成生物工程研究所。

1.2 仪器与设备

Trace气相色谱-质谱（gas chromatograph-mass spectrometry，GC-MS）联用仪 美国Finnigan公司；G3900型气相色谱仪 日本岛津有限公司；ICS3000多功能离子色谱仪 美国Dionex公司；IQ5荧光定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪 美国伯乐有限公司；BILON96-II超声波细胞粉碎机 上海比朗公司；DVB/CAR/PDMS萃取头（50/30 μm） 美国Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 原料处理

将采收的香蕉当天运回实验室，蕉指落梳，并将每梳香蕉切分单个果指，用清水洗净，放入2 g/L的强力中浸泡10 min，然后用浓度均为500 μL/L的抑菌鲜和辉风百克混合溶液浸泡1 min进行杀菌处理，取出晾干备用。将预处理后的样品分为3组，每组120 根香蕉，分别进行如下处理：1）直接将果实放入密封罐中，密封16 h（对照）；2）用50 μL/L乙烯利溶液浸泡1 min，然后自然晾干，3 h后用400 nL/L 1-MCP于密封罐中密封熏蒸16 h（乙烯利+1-MCP处理组）；3）直接用400 nL/L 1-MCP于密封罐中密封熏蒸16 h（1-MCP处理组）。所有处理均在（25±1）℃条件下进行，所有样品处理完后装入厚0.03 mm的防雾保鲜袋内，不封口，装箱置于（25±1）℃条件下贮藏，处理组和对照组在贮藏第14天时取出，用800 μL/L乙烯利催熟，催熟温度为（25±1）℃。各处理均设3个重复。定期监测果实成熟进程，取样及测定挥发性物质的组分与含量。

1.3.2 果实香气物质的测定

参考朱虹等[20]的方法，选用DVB/CAR/PDMS萃取头提取香蕉果实挥发性物质。取香蕉果实中段的果肉，用榨汁机压榨成细小颗粒，取5 g果肉于20 mL采样瓶中，密封瓶盖，将萃取头插入瓶中顶空部分，与样品表面保持1.5 cm距离，萃取温度约为常温，萃取25 min。每处理3个重复，结果取平均值。通过GC-MS技术将采集到的质谱图在NIST谱库搜索，与有关文献进行核对，同时对峰面积进行归一化定量，得到各组分的相对含量，再结合保留时间、质谱、实际成分和保留指数等参数确定香蕉果实中共有8种主要挥发性物质，分别为乙酸异丁酯、丁酸异戊酯、乙酸异戊酯、丁酸丁酯、乙酸乙酯、己醛、反-2-己烯醛以及乙醇。使用G3900型气相色谱仪对这8种挥发性物质进行定量分析，建立GC外标，以标准样品的保留时间对GC谱图的组分峰定性，以峰面积表征各物质含量。

GC条件：25301-U SupelcoWax10极性毛细管柱（30 m×0.53 mm，1 μm）；载气He（99.99%），流速1.0 mL/min，氢火焰离子化检测器，检测器温度250 ℃，进样口温度220 ℃，不分流，固相微萃取进样热解析脱附时间5 min。程序升温：40 ℃保持1 min，以2 ℃/min升温至60 ℃，保持2 min，再以20 ℃/ min升温至180 ℃，保持1 min。

1.3.3 香气代谢相关酶活力的测定

1.3.3.1 脂氧合酶活力的测定

脂氧合酶（lipoxygenase，LOX）活力测定参考朱虹[21]的方法，取1 g果肉于研钵内，加入5 mL预冷的0.05 mol/L磷酸缓冲液（pH 7.0，含体积分数1% Triton X100 和1 g/100 mL聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone，PVP）），冰浴匀浆。然后4 ℃、13 000 r/min离心15 min，取上清液（酶提取液）待测。3 mL的反应体系中含有：0.1 mol/L亚油酸钠溶液0.2 mL、0.1 mol/L柠檬酸-磷酸缓冲液（pH 6.0）2.7 mL和酶提取液0.1 mL。反应体系经30 ℃水浴5 min后加入2.4 mL无水乙醇终止反应，于234 nm波长处测定吸光度。每组实验3次重复。

1.3.3.2 醇酰基转移酶活力的测定

醇酰基转移酶（alcohol acyltransferase，AAT）活力测定参考Pérez等[22]的方法。酶提取液的制备：称取0.4 g果肉样品，加入4 mL蛋白提取液（0.1 mol/L pH 8.0磷酸缓冲液、体积分数0.1% Triton X-100、1 g/100 mL聚乙烯聚吡咯烷酮（polyvinylpolypyrrolidone，PVPP）、1 mmol/L乙二胺四乙酸（ethephon diamine tetra-acetic acid，EDTA），冰浴提取20 min，12 000 r/min离心20 min，上清液即为酶提取液。

AAT活力测定：反应液组成为：2.5 mL 5 mmol/L MgCl2溶液（溶剂为0.5 mol/L pH 8.0磷酸缓冲液）、150 μL 5 mmol/L乙酰辅酶A溶液（溶剂为0.5 mol/L pH 8.0磷酸盐缓冲液）、50 μL 200 mmol/L丁醇溶液（溶剂为0.5 mol/L pH 8.0磷酸缓冲液）和150 μL酶提取液。将以上组分混合后放置于35 ℃水浴15 min，然后添加100 μL 10 mmol/L 5,5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)（5,5’-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)，DTNB），室温下放置10 min，412 nm波长处比色，以不含酶提取液的反应液为空白。以每克鲜组织1 min内吸光度升高0.001为一个活力单位（U），单位为U/g。

1.3.3.3 乙醇脱氢酶活力的测定

参考Lara等[23]的方法进行酶提取液制备。取1 g果肉样品液氮研磨，加入5 mL蛋白提取液（85 mmol/L pH 6.0吗啉乙磺酸（4-morpholineethanesulfonic acid，MES）缓冲液、1 g/100 mL PVPP、5 mmol/L二硫苏糖醇（DL-dithiothreitol，DTT），25 000×g、4 ℃离心15 min，上清液即为酶提取液。乙醇脱氢酶（alcohol dehydrogenase，ADH）活力采用试剂盒进行测定。以每分钟催化产生1 nmol产物的酶量定义为一个酶活力单位（U），ADH活力单位为U/mg，结果以蛋白质量计。

1.3.4 实时荧光定量PCR分析

RNA的分离采用热硼酸法[24]。按照RNA LA PCRTM Kit（AMV）Ver 1.1试剂盒说明书提取香蕉果肉组织样品的总RNA并合成cDNA第1链，贮存于－20 ℃。

根据从NCBI上获得的各个基因的序列，设计荧光引物（表1），选取ACT1为内参基因[25]。按SYBR Premix ExTaqII试剂盒说明配制PCR体系，运行程序为：94 ℃预变性5 min，95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，40个循环。测定其Ct值，用2－ΔΔCt计算各样品各个基因的相对表达量。

表1 研究所用引物Table 1 Primer sequences used in this study

1.4 数据处理与分析

使用Excel 2007软件对数据进行整理与统计分析，结果采用平均值±标准差表示。使用SigmaPlot 10.0软件作图。使用SPSS 13软件对结果进行方差分析，具体采用邓肯氏新复极差（Duncan’s multiple ranger test，DMRT）检验法进行差异显著性分析（P＜0.05为差异显著）。采用R软件进行主成分分析。

2 结果与分析

2.1 乙烯利结合1-MCP处理对香蕉采后果肉中挥发性物质的影响

本课题组前期研究发现，1-MCP处理显著抑制了香蕉果实的香气物质合成，乙烯利+1-MCP处理有效缓解了单独1-MCP处理对香气的影响[11]。反-2-己烯醛和己醛是香蕉绿硬期特征香气物质。从图1可以看出，与对照组相比，乙烯利+1-MCP和1-MCP处理延缓了绿硬期特征香气物质（反-2-己烯醛和己醛）的高峰出现，意味着乙烯利+1-MCP和1-MCP两个处理都能明显延缓香蕉的后熟，同时乙烯利+1-MCP处理组反-2-己烯醛和己醛含量在到达高峰之后快速下降，表明该组果实在催熟之后醛类很快地被转化为其他香气物质。对照组和乙烯利+1-MCP处理中己醛和反-2-己烯醛含量在整个贮藏期间在的变化趋势相同，均先上升后下降。对照组中己醛和反-2-己烯醛的含量高峰都出现在第10天，然后急速下降；乙烯利+1-MCP和1-MCP处理组在催熟前（前14 d）两个物质含量变化缓慢，催熟后上升较快；乙烯利+1-MCP处理组中两种物质的含量高峰都出现在第18天，然后急剧下降；而1-MCP处理中两种物质含量一直处于上升阶段。3个组中两种物质含量高峰出现时间不同，表明了3个组的香蕉成熟进程均不一致。

图1 不同处理对香蕉绿硬时期特征挥发性物质含量的影响Fig. 1 Effects of different treatments on the contents of volatile substances in green ripe bananas

从图2可以看出，乙烯利+1-MCP处理组和1-MCP处理组在香蕉催熟后才有少量的酯类物质产生，乙烯利+1-MCP处理组较1-MCP处理组酯类物质含量上升更快，贮藏末期的含量更高。表明乙烯利+1-MCP处理组中首先乙烯结合香蕉中的乙烯受体，启动乙烯信号通路。乙烯与1-MCP形成竞争能够显著减少1-MCP对香蕉后熟及其香气带来的不良影响。

图2 不同处理对香蕉黄熟期特征挥发性物质含量的影响Fig. 2 Effects of different treatments on the contents of volatile substances in yellow ripe bananas

前期的研究发现乙酸异丁酯、乙酸异戊酯、丁酸丁酯和丁酸异戊酯为香蕉果实的黄熟期特征挥发性化合物[8,10]。如图2所示，黄熟期4种特征物质在各组表现如下：对照组中这4种物质在前10 d含量为0，乙烯利+1-MCP处理组和1-MCP处理组都是在催熟后才有少量的酯类物质产生，果实开始启动成熟后，除乙烯利+1-MCP处理组的乙酸异戊酯含量在第18天有一个高峰外，这两组4种酯类物质含量一直保持上升的趋势，且乙烯利+1-MCP处理组较1-MCP处理组在催熟后能较快地产生这4种特征性酯类物质，在贮藏末期，除了乙酸异戊酯，乙烯利+1-MCP处理组其他3种特征性酯类物质含量高于1-MCP处理组。

乙醇和乙酸乙酯两个物质是过熟期特征挥发性物质，产生这两种物质代表香蕉进入了无氧呼吸阶段和衰老阶段。从图3可以看出，两种物质大量产生的时期都在贮藏末期，在此期间，3个组的香蕉都发生了很强的无氧呼吸；乙烯利+1-MCP处理和1-MCP处理延缓了香蕉进入衰老阶段。对照组在第10天便有少量的乙醇产生，乙酸乙酯的产生出现在第12天，之后两种物质含量一直上升；乙烯利+1-MCP处理组的乙醇和乙酸乙酯都产生于第14天，之后含量也持续上升；1-MCP处理组的乙醇和乙酸乙酯出现分别在第18天和第16天。在贮藏第20天，3组之间的乙醇含量无显著差异，对照组和乙烯利+1-MCP处理组的乙酸乙酯含量有差异，但是差异相对较小，均显著高于1-MCP处理组。总体来说，单独1-MCP处理和乙烯利结合1-MCP处理都明显延缓和抑制香蕉果实不同成熟期特征香气物质形成，但乙烯利+1-MCP处理组与对照组相比各物质含量更接近，其香气物质高峰值都明显高于单独1-MCP处理组。

图3 不同处理对香蕉过熟期特征挥发性物质含量的影响Fig. 3 Effects of different treatments on the contents of volatile substances in over-ripe bananas

2.2 乙烯利结合1-MCP处理对香蕉香气代谢相关关键酶活力和基因表达的影响

2.2.1 LOX活力和基因表达的变化

LOX是香气代谢中脂肪酸代谢途径的重要酶。从图4A可知，各组香蕉在贮藏过程中的LOX活力均先下降后上升，且在贮藏末期LOX活力明显低于初期。对照组LOX活力低峰出现在第10天，此时LOX活力为0.37 U/g，乙烯利+1-MCP组和1-MCP处理组LOX活力低峰均出现在第16天，此时LOX活力分别为0.32、0.38 U/g，两组之间无显著差异。LOX活力变化趋势和己醛、反-2-己烯醛含量的变化趋势完全相反。

如图4B所示，LOX基因在香蕉果肉中的表达量较低，对照组中，LOX基因表达量在贮藏的第10天急剧下降到很低水平，且此后表达量一直保持在低水平。乙烯利+1-MCP处理组和1-MCP处理组在贮藏的0～5 dLOX基因表达量急剧下降，第5天时显著低于对照组。乙烯利+1-MCP处理组LOX基因表达量在0～10 d急剧上升，10 d后逐渐下降，后期与对照组差异不显著。1-MCP处理组LOX基因表达量5～12 d上升，12～14 d下降，14～16 d上升，并在第16天达到高峰，且高于对照组的最高表达量，然后急剧下降到低水平，且在第20天时与其他两组无显著差异。

总体来说，单独1-MCP处理和乙烯利结合1-MCP处理都在贮藏前期提高了LOX活力，贮藏后期抑制了其活力，同时延缓LOX基因表达高峰的出现，但不降低峰值。

图4 不同处理对香蕉LOX活力（A）和LOX基因表达量（B）的影响Fig. 4 Effects of different treatments on the activity (A) and gene expression (B) of LOX

2.2.2 乙醇脱氢酶活力和基因表达的变化

ADH是香气代谢中氨基酸代谢途径的中端酶，该酶的活力与醇类的含量紧密相关，能够催化醛类物质转化为乙醇，乙醇与乙酰辅酶A在AAT催化下形成乙酸乙酯。因此ADH也能够为香蕉中的酯类物质的形成提供前体物质，也是香气代谢的关键酶。如图5A所示，对照组ADH活力在整个贮藏期间不断上升，乙烯利+1-MCP处理组的ADH的活力在催熟前受到抑制，但催熟后ADH活力出现上升趋势。1-MCP处理组活力低于对照组和乙烯利+1-MCP处理组。贮藏结束时，乙烯利+1-MCP处理组和对照组ADH活力无显著差异，且均显著高于1-MCP处理组。

由图5B、C可知，各组香蕉在贮藏过程中ADH基因表达量整体呈现先上升再下降的趋势。乙烯利+1-MCP和1-MCP处理能够延缓香蕉ADH1表达量高峰的出现，并降低峰值大小，且乙烯利+1-MCP处理组ADH1表达量峰值高于1-MCP处理组。1-MCP处理对ADH2基因表达的抑制效果相对ADH1更明显，乙烯利结合1-MCP处理能够有效减弱1-MCP对香气代谢中ADH基因表达的抑制作用。对于ADH2表达量，对照组、乙烯利+1-MCP处理组、1-MCP处理组高峰出现的时间分别为第10、10、12天，且乙烯利+1-MCP处理组和对照组组高峰值无显著差异，但是1-MCP处理组高峰值明显低于对照组和乙烯利+1-MCP处理组高峰值，说明1-MCP抑制了ADH2基因的表达。

图5 不同处理对香蕉贮藏期间ADH活力（A）和ADH1（B）、ADH2（C）基因表达量的影响Fig. 5 Effects of different treatments on the activity of ADH (A) and gene expression of ADH1 (B) and ADH2 (C)

2.2.3 AAT活力和基因表达的变化

AAT是香气代谢中氨基酸代谢途径的重要酶，也是该途径中的末端酶，AAT的活力直接影响到酯类物质的含量。从图6A可知，AAT活力的变化与ADH活力变化趋势一致，对照组AAT活力在整个贮藏期间不断上升，乙烯利+1-MCP处理中AAT活力在催熟前受到一定抑制，其活力低于对照组，但催熟后AAT活力迅速上升。1-MCP处理组AAT活力在整个贮藏期均显著低于对照组和乙烯利+1-MCP处理组。贮藏末期，乙烯利+1-MCP处理组和对照组AAT活力接近，与1-MCP处理组差异显著。

如图6B所示，对照组AAT表达量同ADH表达量变化趋势一致，都是呈现先上升然后下降的趋势。乙烯利+1-MCP处理组中AAT在0～5 d几乎不表达，在前10 d的表达都较低，而后逐步升高再逐步降低。乙烯利+1-MCP和1-MCP处理能够延缓香蕉中AAT基因表达量高峰的出现，却并未降低峰值的大小，乙烯利+1-MCP处理组较1-MCP处理组催熟后AAT基因表达量峰值出现得更早。

图6 不同处理对香蕉AAT活力（A）和AAT基因表达量（B）的影响Fig. 6 Effects of different treatments on the activity (A) and gene expression (B) of AAT

2.2.4BCAT和PDC基因表达量

支链氨基酸转氨酶（branched-chain amino acid transaminase，BCAT）在香蕉香气氨基酸代谢途径中是起始酶，使支链氨基酸亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸等进行转氨基后转换为对应的酮酸，为香气代谢提供前体物质。从图7A可知，各组果实BCAT表达量在前10 d较低，对照组在第12天急剧上升至高峰，而后逐步降低至平稳状态；乙烯利+1-MCP处理组BCAT表达量在12 d后开始逐渐上升，至第18天到达高峰；1-MCP处理组在14 d后才开始逐渐上升，至第20天达到表达高峰。乙烯利+1-MCP和1-MCP处理能够延缓香蕉中BCAT基因表达量高峰的出现，却并未降低峰值的大小。相对单独1-MCP处理，乙烯利+1-MCP处理诱导了香蕉果实在成熟期BACT表达。

丙酮酸脱羧酶（pyruvate decarboxylase，PDC）是香蕉香气氨基酸代谢途径中的中间酶。由图7B可知，PDC表达量没有典型的变化趋势，乙烯利+1-MCP和1-MCP处理能够延缓香蕉PDC基因表达量高峰的出现，并降低峰值的大小，其中1-MCP处理抑制效果更加明显。1-MCP会抑制香气代谢中PDC基因的表达，从而抑制了香气物质的生成，乙烯利结合1-MCP处理会一定程度减轻这种抑制作用。

图7 不同处理对香蕉香气代谢中BCAT（A）和PDC（B）基因表达量的影响Fig. 7 Effect of ethephon combined with 1-MCP on the expression of BCAT (A) and PDC (B) genes

2.2.5 香气成分含量与香气合成关键酶活力和基因表达量相关性分析

如表2所示，己醛含量与ADH1表达量呈极显著相关；反-2-己烯醛含量与LOX活力显著相关，与ADH1表达量呈显著相关，乙醇含量与ADH活力呈显著相关，与AAT活力呈极显著相关；酯类含量与ADH活力、AAT活力都均呈极显著相关；总挥发性物质含量与ADH活力、AAT活力也呈显著或极显著相关。各基因中，仅ADH1表达量表现出与挥发性物质中的醛类物质含量有极显著相关性，其他基因的表达量与挥发性物质含量均未表现出显著相关性，说明香气代谢中的相关酶与香气代谢的关系比基因表达与香气代谢的关系更为密切。

表2 贮藏期间香蕉香气物质含量与相关酶活力、基因表达量之间的相关性分析Table 2 Correlation analysis of volatile substances with enzyme activities and gene expression in banana fruits during ripening process

2.3 主成分分析

香蕉的香气物质主要在果实成熟后期形成。为了研究不同处理对香气物质的影响，对贮藏12 d后所有测定指标进行了主成分分析。如图8所示，PC1和PC2可以解释所有组分的68.8%，其中PC1占46.89%，PC2占21.91%。相对于对照，不同处理都对香蕉果实后期的香气成分和酶活力以及基因表达量产生了显著影响（图8A）。尽管不同处理组没有完全分开，但是不同处理组之间差异显著（R2=0.22、P=0.005）。从图8B中可以出，乙酸乙酯、丁酸异戊酯、丁酸丁酯、乙酸异戊酯、乙酸异丁酯、乙醇含量和ADH、AAT活力为主成分PC1的主要的贡献者，这也和香蕉成熟过程中的特征香气物质相符合。而己醛含量和AAT、ADH2、PDC、BACT基因表达量，以及反-2-己烯醛含量为主成分PC2的主要贡献者。这解释了这些香气物质、酶活力以及基因表达对香蕉果实后期香气物质的贡献较大。而表3展示的是不同处理样品对于主成分的贡献值，与对照相比，1-MCP处理整体上对主成分PC1和PC2的影响更大，而乙烯利+1-MCP处理相对单独1-MCP处理来说，对主成分PC1和PC2的整体影响较小。说明乙烯利+1-MCP处理能显著减轻单独1-MCP处理对果实香气物质的影响。

图8 不同处理条件下香蕉果实贮藏12 d后各指标之间主成分分析（A）及各指标在主成分PC1和PC2中的比重（B）Fig. 8 Principal components analysis (PCA) of aroma components,aroma synthesis-related enzyme activities and gene expression in banana fruits under different treatment conditions after 12 days of storage (A)and contribution of each component to PC1 and PC2 (B)

表3 不同样品对主成分贡献值Table 3 Contribution of first five PCs to total variance for different samples

3 讨 论

3.1 乙烯利结合1-MCP处理对香蕉中香气物质形成的影响

1-MCP对果实风味的影响主要是抑制其芳香物质的形成，果实的挥发性醇和酯总量减少[14]。香蕉果实主要在呼吸跃变高峰出现前后产生挥发性芳香物质，香蕉果实在成熟后期产生大量的酯类，这是果香型香气的主要成分，酯类物质的产生需要乙烯的作用，而1-MCP处理明显降低了组织对乙烯的敏感性。1-MCP处理导致果实呼吸速率下降和代谢活性的下降，可能导致香气合成底物供给不足，从而改变挥发性物质形成的途径，进而改变了芳香物质的量。不仅在香蕉上有这样的结果，在苹果、油桃、梨、猕猴桃、桃等水果中都有类似的现象[15-18]。在采收成熟度较高的粉蕉果实上，1-MCP处理浓度过高或时间过长，也会导致粉蕉果实果皮转色和果肉软化不一致[26]，这些都限制了1-MCP在香蕉贮藏保鲜中的应用。

乙烯利+1-MCP处理不但能显著延缓香蕉衰老和延长保鲜期，解决1-MCP引起的果皮转黄不均匀的后熟障碍问题，而且能极大改善香气的种类、总量、酯类含量。乙烯利+1-MCP处理组香蕉果实对乙烯有正常的响应，挥发性物质含量相对于单独1-MCP处理组上升更快[11]。在本实验中进一步验证了1-MCP结合乙烯利处理可以显著减轻单独1-MCP处理对香气物质形成的影响。

香气的产生与乙烯的作用密切相关。乙烯实际上是通过调节香蕉后熟进程而间接影响其挥发性物质的变化。相关研究发现，外源乙烯能增加苹果特征香气物质积累，而乙烯作用抑制剂1-MCP则起着相反的作用，显著抑制了苹果“果香型”香气物质的含量，乙烯和1-MCP通过调控香气合成相关基因的表达，调控香气的合成[16]。苹果低温贮藏条件下乙烯释放量和特征香气物质含量呈显著正相关性，因此乙烯释放量可以作为评价苹果香气物质的潜在指标，达到无损简易检测的目的[27]。Shalit等比较了呼吸跃变型和非跃变型两种甜瓜品种的香气物质，发现跃变型果实能产生大量乙烯，有很浓的香气；非跃变型果实释放的乙烯较少，而香气也较淡[28]。新近的研究报道，甜瓜中乙烯合成关键基因ACO1的RNA干扰显著影响了果实成熟，主要通过影响相关基因的低甲基化，抑制了成熟相关基因的表达，进而影响氨基酸分解代谢的芳香族化合物的积累[29]。番茄果实中，果实成熟相关的自催化系统II乙烯对番茄成熟期特征香气物质的形成起着至关重要的作用，决定了番茄红熟期的风味[30]。最新的研究发现，乙烯可以通过调控转录因子NOR/NAC的甲基化修饰，调控酯类代谢关键基因AAT的甲基化修饰，调控其表达，进而调控不同果实包括番茄、桃和苹果的酯类物质形成[31]。对于非呼吸跃变型果实的香气物质形成，乙烯也起着重要的作用。Sdiri等分析了乙烯退绿对不同品种柑橘香气的影响，发现一些柑橘品种的香气也受到乙烯处理的影响[32]。本课题组前期研究也发现，香蕉果实成熟过程中乙烯的释放量与乙醇、酯类物质和总挥发性物质的释放量呈极显著正相关[11]。

本实验研究发现，1-MCP处理降低了香蕉挥发性物质的总量和酯类含量，在贮藏末期也未能改变这种现象，挥发性物质的总量和酯类含量仍然低于对照组。而用1-MCP结合乙烯的香蕉与1-MCP处理组相比，提高了挥发性物质的总量和酯类含量，有效地改善了1-MCP对香蕉香气的抑制作用，这种作用在催熟后更为明显，也表明了乙烯对香气调控的重要作用。对于梨果实，长期低温贮藏后，相对于单独1-MCP处理来说，1-MCP结合乙烯处理也能显著改善货架期梨果实的香气，有效保持果实的风味[33]。

3.2 乙烯利结合1-MCP处理对香蕉香气脂肪酸代谢途径相关酶活力和基因表达的影响

果实香气成分中的直链脂肪族醇、醛、酮和酯类物质主要来源于脂肪酸氧化。直链脂肪族醛类及其他香气物质主要通过脂肪酸代谢途径中的β-氧化和LOX氧化实现。LOX氧化产生的C6醛和C6醇等果实青香气味[34-35]。脂肪酸作为酯类合成的前体之一，主要通过β-氧化和LOX氧化这两种途径生成。LOX催化植物中亚油酸、亚麻酸这两种主要的多聚不饱和脂肪酸底物发生过氧化氢化反应，产生9-(S)-或13-(S)-氢过氧十八碳二烯酸或9-(S)-或13-(S)-氢过氧十八碳三烯酸，经过进一步代谢，如经氢过氧化物裂解酶催化转化为醛类、醇类和挥发性酯类[36]，所以LOX在果实直链型挥发性物质的生成过程中起到了重要作用。

在本研究中，香蕉贮藏过程中LOX活力变化趋势和己醛、反-2-己烯醛含量的趋势完全相反，对照组、乙烯利+1-MCP处理组和1-MCP处理组的LOX基因表达量峰值出现的时间依次延后，说明乙烯利+1-MCP和1-MCP处理能够延缓香蕉中LOX基因的表达。相关性分析发现己醛含量与LOX活力、LOX基因表达量无显著相关性，推测己醛的产生与LOX活力和LOX基因表达关系不大。有研究报道称，果实芳香成分中直链脂肪族醇、醛、酮物质主要来源于脂肪酸代谢路径。部分果实的芳香挥发物合成途径中，脂肪酸是主要的前体物质，脂肪酸经过氧化作用成类脂，然后经LOX催化形成醛、酮、酸、醇、内酯和酯等芳香物质[37]。完整果实的芳香挥发物通过β-氧化途径合成[37]，而当果实组织腐烂后则通过LOX途径合成，因此推测香蕉绿硬时期的特征香气物质中的直链脂肪族醛类并不是来源于LOX途径，而主要是通过β-氧化路径合成。

3.3 乙烯利结合1-MCP处理对香蕉香气氨基酸代谢途径相关酶活力和基因表达的影响

果实香气成分中支链脂肪族醇、醛、酮和酯类物质主要来源于氨基酸代谢。氨基酸通过转氨作用形成支链酮酸，一条途径是在脱羧酶作用下生成醛，然后在ADH的作用下生成醇；另一条途径是与辅酶A（CoA）生成酰基CoA，然后在AAT作用下生成酯。支链氨基酸首先通过转氨基作用生成支链α-酮酸，这个过程需要在BCAT催化作用下进行，再在PDC的作用下脱羧生成相应的醛类。

3.3.1 乙烯利结合1-MCP处理对ADH活力及基因表达的影响

脂肪酸和氨基酸代谢产生的醛在ADH的作用下形成醇类物质。苹果中的ADH以NAD和NADH为辅因子，其ADH在体外pH值为5.5～6.0时将醛还原成醇，pH值为7.0～10.0时将醇氧化为醛[38]。因此，ADH可能与香蕉香气中的醇类和醛类含量有着密切的联系。Defilippi等发现1-MCP并不会影响ADH的活力，但会抑制AAT活力[39]。

本实验结果表明，乙烯利+1-MCP处理会抑制ADH活力，但该抑制作用并不是不可逆的，在果实催熟后，该酶活力很快出现上升的趋势，乙烯利+1-MCP和1-MCP处理能够延缓香蕉中ADH1基因表达量高峰的出现，且降低了峰值的大小。乙烯利+1-MCP处理组ADH1基因表达量峰值较1-MCP处理组更大；1-MCP处理明显抑制了ADH2基因的表达，使其整个贮藏过程表达量都很低，而乙烯利+1-MCP处理组ADH2表达量与对照组整体上差异不大；表明乙烯利结合1-MCP处理能够有效降低或者消除1-MCP对香气代谢中ADHs基因表达的抑制，以此达到增加香气物质和改善果实品质的目的。ADHs基因表达量的高峰出现时间早于ADH活力高峰出现时间，乙醇含量和ADH活力变化趋势一致，但ADH活力开始快速增加时间点早于乙醇，因此，当ADHs基因表达量达到高峰之后，ADH活力才快速上升，然后才产生大量的乙醇。推测香气的形成与ADH活力和ADH基因表达具有显著的相关性。

3.3.2 乙烯利结合1-MCP处理对AAT活力及基因表达的影响

酯类物质的合成由醇和酰基-CoA在AAT的作用下合成，这一过程为需氧过程[38]。AAT活力及其对底物的选择性影响果实香气成分中酯类的含量和种类。Pérez等对4个品种草莓果实成熟期间AAT活力的研究表明，各品种AAT活力均随果实成熟而增加，但不同品种最大活力差异很大，活力越低风味也越差[22]。缺乏香气的甜瓜品种‘Rochet’果实无AAT活力[28]。香蕉果实AAT最适底物为乙酰-CoA、丙酰-CoA和丁醇，而对丁酰-CoA活力很低[40]。醇的供应被认为是AAT催化酯类合成的限制因子，体外供应丁醇，苹果果实的乙酸丁酯和丁酸酯类合成增加，体外供应乙醇和己醇则促进乙酯和己酯的合成[39]。因此，AAT可能与香蕉香气中的酯类物质的合成密切相关。

本实验结果表明，AAT活力在整个贮藏期间不断上升，贮藏结束时，乙烯利+1-MCP处理组和对照组AAT活力接近，且显著高于1-MCP处理组。这表明乙烯利+1-MCP处理对AAT活力的抑制作用不是不可逆的。乙烯利+1-MCP和1-MCP处理能够延缓香蕉AAT基因表达量高峰的出现，却并未降低峰值的大小。结合挥发性物质的量分析，酯类含量和AAT活力变化趋势一致，当AAT基因表达量达到高峰之后，才出现较高的AAT活力，继而产生大量的酯类物质产生。因此酯类的含量与AAT活力具有极显著的相关性，AAT在酯类的生成过程中发挥着至关重要的作用。

3.3.3 乙烯利结合1-MCP处理对氨基酸途径中BCAT和PDC基因表达的影响

BCAT通过转氨基作用将缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸转化为酮酸，酮酸再在PDC的作用下脱羧生成相应的醛类[41]，这两个酶是氨基酸代谢途径的起始酶，因此BCAT和PDC基因表达也与香气代谢密切相关。但是关于1-MCP对BCAT和PDC基因表达的影响较少报道。本实验中，乙烯利+1-MCP和1-MCP处理能够延缓香蕉中支链BCAT基因表达高峰的出现，却并未降低峰值的大小。对照组PDC基因表达量呈现上升后下降再上升再下降的趋势。乙烯利+1-MCP和1-MCP处理能够延缓香蕉PDC基因表达量高峰的出现，降低了峰值的大小，但是1-MCP处理组PDC表达量高峰仅在贮藏后期才出现，而乙烯利+1-MCP处理和对照组PDC基因表达量峰值都出现在贮藏前期。说明1-MCP会影响了PDC基因表达，从而影响了香气物质在贮藏期的生成，而乙烯利结合1-MCP处理能减轻了这种影响，在贮藏前期便出现表达高峰。

本实验揭示了乙烯利+1-MCP处理对香蕉成熟过程中挥发性物质、香气合成相关关键酶活力和相关基因的表达特性的影响以及它们之间的关系，为香蕉采后的1-MCP处理保鲜技术提供理论指导，也为1-MCP处理在香蕉产业上的商业应用提供技术支撑和理论参考。