二甲双胍通过己糖激酶2调节糖酵解途径抑制卵巢癌细胞增殖和迁移

林莉香 云红叶 黄守国 (中南大学湘雅医学院附属海口医院妇产科，海南 海口 570208)

卵巢癌是最致命的女性妇科肿瘤之一，因卵巢癌早期症状不明显，多数患者发现时已处于中晚期，导致死亡率较高〔1〕。目前临床上治疗卵巢癌的手段主要为外科手术和全身化疗，但仍具有较高的复发率〔2〕。二甲双胍是治疗糖尿病的一种有效药物，越来越多的研究已经证实二甲双胍在治疗妇科相关肿瘤中同样具有显著的疗效〔3～5〕，例如研究〔6〕发现二甲双胍可通过介导信号转导及转录激活蛋白(STAT)3信号通路抑制卵巢癌细胞的恶性生物学行为，进而发挥抗癌作用，然而二甲双胍在卵巢癌中的作用机制尚未完全明确。有研究发现己糖激酶(HK)2在卵巢癌组织中高表达，且高表达的HK2可显著促进卵巢癌细胞增殖〔7〕，本研究旨在探讨二甲双胍对卵巢癌细胞增殖、迁移及糖酵解的影响。

1 材料与方法

1.1细胞与试剂 SKOV3细胞购自碧云天生物技术有限公司。二甲双胍粉末(纯度：≥98%，货号：D9351)购自北京索莱宝有限公司；Lipofectamine 2000、DMEM、青霉素、链霉素购自北京杰辉博高生物技术有限公司；CCK-8试剂购自爱必信(上海)生物科技有限公司；HK2抗体(HK8797)购自上海户实科技有限公司；E-钙黏附蛋白(E-cadherin)抗体(ab40772)、锌指转录因子(Snail)抗体(ab216347)、β-actin抗体(ab115777)购自Abcam公司，辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗(AS003)购自苏州远东普惠生物技术有限公司；葡萄糖摄取比色检测试剂盒(MAK083-1KT)、乳酸比色测定试剂盒(MAK058-1KT)购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司；ATP比色试剂盒(BJ-S6336)购自上海邦景实业有限公司；pcDNA-NC和pcDNA-HK2由上海吉玛生物技术有限公司提供。

1.2细胞培养〔8〕参考文献〔4〕的方法复苏细胞，观察细胞，当细胞密度达到90%时进行传代：用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗细胞2次后去除血清，用500 μl的胰酶(含DMEM)进行消化，37℃，5% CO2培养箱静置4 min后加入1 ml DMEM完全培养基终止消化，离心后(1 000 r/min，5 min)弃上清，加入1 ml DMEM重悬细胞，于条件为37℃，5%CO2培养箱中进行培养。

1.3细胞转染与分组〔9〕当细胞融合度≥80%时，收集细胞，用不同浓度的二甲双胍(0 mmol/L、5 mmol/L、10 mmol/L、20 mmol/L)处理细胞，记为0、5、10、20 mmol/L Met组，进行增殖迁移等系列实验，选用作用效果最好的二甲双胍剂量组进行后续研究。二甲双胍的配制参考文献〔4〕，并将细胞分为Met+pcDNA-NC组(最佳剂量二甲双胍+转染pcDNA-NC)，Met+pcDNA-HK2组(最佳剂量二甲双胍+转染pcDNA-HK2)，待细胞融合度≥80%时，根据Lipofectamine2000操作说明分别把pcDNA-NC和pcDNA-HK2转染至SKOV3细胞，培养48 h后收集细胞进行后续实验。

1.4CCK-8实验检测SKOV3细胞增殖〔10〕收集各组细胞，将细胞接种于96孔板上，密度为6 000个/孔，培养箱培养24 h后，每孔加入10 μl的CCK-8试剂，继续培养2～3 h，之后用酶标仪于450 nm处测定吸光值，之后的每天同一时间点加入CCK-8试剂，培养2～3 h后检测吸光值，共检测4 d。

1.5SKOV3细胞葡萄糖摄取、乳酸生成和ATP含量的测定〔11〕参考文献〔4〕的方法，将细胞接种于96孔板中，用100 ml KRPH缓冲液(含2%牛血清白蛋白)孵育细胞40 min 后加入10 ml L2-DG，20 min后根据葡萄糖摄取试剂盒说明进行测定。乳酸和ATP含量的测定严格按照乳酸测定试剂盒和ATP比色试剂盒操作说明书进行操作。

1.6Transwell检测SKOV3细胞迁移能力〔12〕收集各组细胞，用无血清培养基处理细胞，Transwell小室膜水化预处理后，上室加入100 μl的细胞悬液，下室加入完全培养基，培养箱培养24 h后，进行固定和染色，随机选取视野显微镜下进行观察，并记录。

1.7Western印迹检测SKOV3细胞中HK-2、E-cadherin和Snail蛋白的表达〔13〕收集各组细胞，用PBS洗涤，加入放射免疫沉淀试验(RIPA)裂解液，裂解30 min后离心，收集上清，利用二喹啉甲酸(BCA)法测定蛋白，进行定量，根据定量的结果进行电泳并转膜，并用5%的脱脂牛奶进行封闭1 h，然后加入HK2(1∶500)、E-cadherin(1∶10 000)、Snail(1∶1 000)、β-actin(1∶200)一抗，4℃孵育过夜。加入HRP标记的二抗(1∶2 000)，共孵育1 h后，加入电化学(ECL)发光液进行曝光。

1.8统计学分析 采用SPSS26.0软件进行t检验、方差分析。

2 结 果

2.1二甲双胍对卵巢癌细胞增殖的影响 不同浓度的二甲双胍处理卵巢癌SKOV3细胞72 h后，卵巢癌细胞的增殖均受到显著抑制(P<0.05)，其中20 mmol/L二甲双胍组对细胞增殖的抑制效果最明显。见表1。

表1 各组不同时间点OD值比较

2.2二甲双胍对卵巢癌细胞迁移的影响 与0 mmol/L Met组相比，其他组SKOV3细胞迁移数目、Snail蛋白表达量显著减少(P<0.05)，而E-cadherin的蛋白表达量显著增加(P<0.05)，20 mmol/L Met组效果最明显(P<0.05)，见图1，表2。

1～4:0 mmol/L Met组，5 mmol/L Met组，10 mmol/L Met组，20 mmol/L Met组；图2同图1 二甲双胍对卵巢癌细胞E-cadherin和Snail蛋白表达的影响

表2 各组迁移数目、E-cadherin、Snail蛋白表达水平、葡萄糖摄取、乳酸产生、ATP浓度比较

2.3二甲双胍对卵巢癌糖酵解的影响 由表2可见，不同浓度的二甲双胍处理细胞后，与0 mmol/L Met组相比，其他组葡萄糖摄取、乳酸产生及ATP浓度均显著下降(P<0.05)，但5 mmol/L Met组的葡萄糖摄取除外(P>0.05)，20 mmol/L Met组效果最明显(P<0.05)。

2.4二甲双胍对HK2表达的影响 与0 mmol/L Met组HK2蛋白水平(0.94±0.09)相比，5、10、20 mmol/L Met组〔(0.72±0.07)、(0.62±0.08)、(0.41±0.06)〕均显著降低(P<0.05)，20 mmol/L Met组效果最明显(P<0.05)，见图2。

图2 二甲双胍对卵巢癌细胞HK2蛋白表达的影响

2.5二甲双胍通过HK2抑制卵巢癌细胞增殖 与Met+pcDNA-NC组相比，Met+pcD-NA-HK2组48 h后细胞增殖和HK2蛋白表达水平均显著增加(P<0.05)，见图3、表3。

1，2：Met+pcDNA-NC组，Met+pcDNA-HK2组；下图同图3 各组卵巢癌细胞HK2蛋白表达的比较

表3 各组细胞HK2蛋白表达水平以及OD值的比较

2.6二甲双胍通过HK2抑制卵巢癌糖酵解途径与Met+pcDNA-NC组相比，Met+pcDNA-HK2组葡萄糖摄取、乳酸产生及ATP浓度显著增加(P<0.05)。见表4。

表4 各组细胞葡萄糖摄取、乳酸产生和ATP浓度、迁移数目、E-cadherin、Snail蛋白水平的比较

2.7二甲双胍通过HK2抑制卵巢癌细胞迁移 与Met+pcDNA-NC组相比，Met+pcDNA-HK2组的细胞迁移数目和Snail蛋白水平均显著升高(P<0.05)，而E-cadherin的蛋白表达量显著减少(P<0.05)。见表4、图4。

图4 各组细胞E-cadherin和Snail蛋白表达的比较

3 讨 论

铂类化疗是临床上治疗卵巢癌的主要手段之一，但化疗的失败是导致卵巢癌复发的主要原因〔14〕。研究发现二甲双胍抗肿瘤有显著疗效，曹妮妮等〔15〕发现二甲双胍可显著抑制肺癌细胞的增殖和迁移。研究发现二甲双胍可抑制卵巢癌细胞的增殖及迁移能力〔4〕，邹歌等〔16〕研究已证实二甲双胍可抑制卵巢癌细胞的迁移。

肿瘤细胞即使在有氧环境下仍然进行无氧糖酵解，这种现象的发生可以增加代谢通量向多个生物途径转移，产生的能量可促进肿瘤细胞的增殖〔17〕。目前已有研究证实糖酵解途径参与卵巢癌的发生和发展〔18〕。本研究结果提示二甲双胍可通过调控糖酵解途径抑制SKOV3细胞的增殖和迁移。在正常情况下，HK2位于细胞质和线粒体上，HK2的主要作用就是参与糖酵解，为细胞提供能量。线粒体中产生的ATP会通过线粒体通透性转换孔(mPTP)释放到细胞质中，然后构成mPTP的HK2和电压依赖性阴离子选择性通道蛋白(VDAC)1的结合会得到附近的能量供应，从而促进糖酵解的发生〔19〕。本研究结果发现HK2可扭转二甲双胍对SKOV3细胞增殖、糖酵解及细胞迁移的抑制。

综上，二甲双胍可通过下调HK2的表达抑制SKOV3细胞糖酵解，进而抑制SKOV3细胞的增殖和迁移。