不同生长阶段猪粪四环素，头孢及双抗耐药细菌的数量比较研究

李 倩，何 超，龙 敏，杨继勇，孙丽坤,*

(1.甘肃农业大学动物科学技术学院，甘肃 兰州 730070；2.甘肃农业大学动物医学院；3.中国农业科学院研究生院)

抗生素是20 世纪最重要的医学发现之一，在疾病的救治中发挥了不可替代的作用。目前，抗生素主要被用于人类医疗和动物畜禽养殖。随着畜禽养殖业的规模化、集约化发展，畜禽传染性疾病发生的可能性持续增加，抗生素使用的种类和数量也随之增加。如四环素类、头孢菌素类、氨基糖苷类、青霉素类、氟喹诺酮类等都是CLSI已公布的耐药判定标准的兽用抗生素。在畜禽养殖过程中，抗生素常作为一种饲料添加剂添加于动物饲料，不仅可以杀灭和抑制畜禽肠道内的有害菌，阻止有害微生物的增殖，从而维持畜禽正常的微生态平衡，降低发病率，而且微量的抗生素能够刺激脑下垂体，从而促进促生长激素的分泌，有效加快畜禽生长发育速度。正因为兽用抗生素具有降低动物发病率和促进生长这样的双重功效，所以在养殖业中长期以亚剂量添加于动物饲料，并且能为畜禽养殖带来可观的经济效益，现已构成抗生素在全球范围使用的格局。

我国是世界上养猪第一大国，生猪存栏量、肉猪出栏量、猪肉的产量都位居世界第一位。但是，近年来，猪的各种疾病不断发生，对我国养猪业的发展产生了很大的影响。因此，在这种背景下，抗生素在养猪生产中发挥着越来越重要的作用。但是由于近年来养殖场普遍存在对抗生素长期使用和滥用的现象，导致抗生素残留、动物肠道产生耐药细菌等问题日益凸显。并且摄入动物体内的抗生素大多未能被充分吸收和代谢，约有30%～90%伴随动物粪便排泄进入环境中，抗生素在环境中浓度的增长使得抗生素的选择压力加大，促进了微生物原来所固有的抗性基因水平的提高，进而加速了耐药细菌的出现。一旦有耐药基因转移至致病菌，那么对控制疾病的难度就会增加，这对人类的健康产生了巨大的威胁，所以耐药细菌已逐渐成为危害公共健康的污染物而备受研究者们的关注。目前，已有部分关于家畜粪便细菌耐药性的研究，但是主要是探讨耐药细菌的种类和耐药基因的分布情况，而对于同一品种不同生长阶段猪粪便中耐药细菌及多重耐药细菌的数量的比较研究不多，缺乏系统的风险评估。

因此，本实验选取了兰州市附近某养猪场的约克夏猪猪粪作为研究对象，采用微生物培养的方法，通过对不同生长阶段猪粪中抗生素耐药细菌的数量比较分析，对规模化养猪过程中抗生素的合理使用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 样品的采集

选择兰州市附近某猪场(存栏量>1 000头)中的约克夏猪猪粪作为样品来源，采用五点混合取样法，即选定猪场的采样粪区后，先划定好粪区对角线，然后将其中点作为中心抽样点，最后在两条对角线上选择与中心抽样点距离相等的4个点作为采样点，五点取样之后将采集到的样品充分混合。分别对该猪场内的哺乳仔猪(30 d以内)、断奶仔猪(60 d以内)、育肥猪(90 d以内)、空怀母猪进行了取样，并注明样品名称和采样时间，将所采集的样品各自混匀后置于冰盒带回实验室，24 h内进行细菌培养实验，其余样品于-20 ℃保存。

1.2 培养基制备

1.2.1 LB固体培养基制备 在950 mL去离子水中加入胰蛋白胨10 g，氯化钠10 g，酵母提取物5 g，琼脂粉15～20 g。摇动锥形瓶使溶质全部溶解，再用5 mol·L-1的NaOH将溶液的pH调至7.0，然后用去离子水定容至1 L，最后置于高压灭菌锅内，在121 ℃下高压灭菌20 min。灭菌后取出，待培养基温度降至50 ℃左右时，在超净工作台内将其倒入灭过菌的培养皿中，厚度不宜超过2/3，且倾倒过程应避免产生气泡。冷却后用封口胶封边，倒置放于4 ℃保存备用，或直接用于涂板。

1.2.2 含药液体培养基制备 同上述配方配置LB培养基并进行高压灭菌，待培养基冷却到50 ℃左右时，分别加入对应抗生素，充分摇匀，然后同上述操作方法进行倒板备用。

1.3 数据统计分析

1.3.1 好氧异氧细菌的培养与计数 分别称取四个不同生长阶段的新鲜猪粪样品各3 g于三角瓶中，并加入30 mL无菌水和玻璃珠，摇床震荡8 h，制备成菌悬液。采用平板菌落记数法，吸取混合均匀的菌悬液上清液进行梯度稀释，选择10～3 g·mL-1、10～4 g·mL-1、10～5 g·mL-1三个梯度分别涂布在制备好的LB平板上，每一梯度均设置3个重复，置于恒温箱37 ℃培养24 h。计数LB平板上的总可培养细菌数，并根据菌落数和稀释度计算得出猪粪样品中的细菌浓度。

同时将试验数据用SPSS 22.0统计软件进行独立样本t检验，以P≤0.05表示差异显著，以0.05

1.3.2 单一耐药细菌和双重耐药细菌的培养与计数 根据1.2.2中含药液体培养基的制备方法，本实验选择四环素和头孢氨苄两种抗生素，配置成初始浓度均为50 mg·mL-1的母液，使用时分别取适量上述抗生素母液，加入到已经灭菌的LB培养基中，使其终浓度分别为四环素32 μg·mL-1、头孢氨苄64 μg·mL-1，制备单一抗生素抗性平板。多重抗生素平板的制备是将上述两种抗生素混合后加入灭菌培养基中，每种抗生素的终浓度均为相应的单一抗生素平板上所使用的浓度。

将1.3中制备好的菌悬液样品，以同样的稀释度涂布于单一抗生素平板和多重抗生素的平板上，37 ℃培养24 h，计数分别含四环素和头孢氨苄的单一抗生素平板和双抗平板上的耐药细菌数，并按照以下公式计算耐药细菌的比例。

耐药细菌比例(%)=耐药细菌数量÷细菌总数×100%

2 结果与分析

养猪场的规模化发展使得其成为了抗生素的“使用大户”，且在生猪养殖过程中，抗生素的使用大多在幼猪时期，成年猪由于生长机能和疾病抵抗能力较强而很少使用。因此按照材料和方法所述，选择该养殖场普遍使用的四环素、头孢氨苄作为耐药细菌筛选的抗生素类型。根据CLSL(抗菌药物敏感性实验执行标准) ，这两种抗生素的最低抑菌浓度(MIC)分别为：头孢氨苄≥64 μg·mL-1，四环素≥16 μg·mL-1，本实验选择等于和略高于其MIC值的最终工作浓度，即头孢氨苄64 μg·mL-1、四环素32 μg·mL-1。分别取哺乳仔猪、断奶仔猪、育肥猪和空怀母猪四个不同生长阶段的猪粪进行抗性细菌培养，部分培养结果比较如图1所示。

图1 空白对照，四环素，头孢细菌培养图

并对4组猪粪样品中可培养的菌株进行了统计，得出总可培养细菌数量为8.00×107～1.07×1010cfu·g-1，单抗和2种抗生素耐药细菌数量和总可培养细菌总数在同一个数量级或低一个数量级。其中单一耐药细菌数量为1.00×107～8.51×109cfu·g-1，双重耐药细菌数量为 0～8.99×109cfu·g-1。

将统计结果进行SPSS分析，结果如表1所示，猪的四个生理阶段中，四环素组、头孢氨苄组及四环素+头孢氨苄组均与对照组产生显著差异(P<0.05)。

表1 不同生长阶段猪粪四环素，头孢及双抗耐药细菌的数量比较

根据以上统计结果，可进一步比较不同生长阶段猪粪便中单一耐药菌与双重耐药菌占总细菌的比例，其具体分析结果如下。

2.1 不同生长阶段猪粪中四环素耐药细菌的分布

耐药细菌检测结果表明，哺乳仔猪、断奶仔猪、育肥猪以及空怀母猪粪便中四环素耐药细菌数量分别是0.09×109cfu·g-1、7.82×109cfu·g-1、2.84×109cfu·g-1、1.99×109cfu·g-1。四个阶段四环素耐药细菌数量均和总可培养细菌数量在同一个或低1个数量级。如图2所示，断奶仔猪粪便中耐四环素细菌的比例为73.02%，明显高于育肥猪粪便(27.63%)、空怀母猪粪便(22.26%)以及哺乳仔猪粪便(0.98%)，并且哺乳仔猪粪便中耐药细菌所占比例最低。

2.2 不同生理阶段猪粪中头孢氨苄耐药细菌的分布

根据耐药细菌检测结果，哺乳仔猪、断奶仔猪、育肥猪以及空怀母猪粪便中头孢氨苄耐药细菌数量分别是3.42×109cfu·g-1、7.66×109cfu·g-1、8.51×109cfu·g-1、3.60×109cfu·g-1。四个阶段头孢氨别耐药细菌数量均和总可培养细菌数量在同一个或低1个数量级。如图3所示，育肥猪粪便中耐头孢氨别细菌的比例为82.78%，稍高于断奶仔猪粪便(71.52%)，而明显高于空怀母猪粪便(40.27%)以及哺乳仔猪粪便(37.33%)，并且哺乳仔猪粪便中耐药细菌所占比例最低。

图2 不同生长阶段猪粪中四环素耐药细菌比例

图3 不同生长阶段猪粪中头孢氨苄耐药细菌比例

图4 不同生长阶段猪粪中双重耐药细菌比例

2.3 不同生理阶段猪粪中双重耐药细菌的分布

双抗耐药细菌培养结果表明，哺乳仔猪粪便中没有检测到双重耐药细菌。耐药细菌检测结果表明，断奶仔猪、育肥猪以及空怀母猪粪便中双重耐药细菌数量分别是8.99×109cfu·g-1、1.85×109cfu·g-1、7.30×108cfu·g-1。这三个阶段猪粪便中双重耐药细菌数量比总可培养细菌数量低1～2个数量级，和四环素、头孢耐药细菌数量在同一个或低1个数量级。各生理阶段双重耐药细菌占总可培养细菌的比例如图4所示，其中断奶仔猪粪便中双重耐药细菌的比例为83.94%，明显高于育肥猪粪便(18.00%)、空怀母猪粪便(8.17%)。并与2.1和2.2的结果对比，四个生长阶段猪粪便中双重耐药细菌比例均低于单一抗生素。

3 讨 论

随着规模化、集约化的畜禽养殖业的快速发展以及畜禽饲养密度的加大，粪便等废弃物的产出量逐渐加大，抗生素的使用更加频繁。现在有许多研究已经证明，抗生素耐药细菌广泛存在于畜禽粪便中。相对于养牛场、养羊场以及养鸡场，在生猪养殖过程中抗生素的使用量更大，猪粪便中存在的耐药细菌占比更大，也吸引了更多研究者的关注。因此本实验也选择养猪场作为样品来源，并分别采集哺乳仔猪、断奶仔猪、育肥猪以及空怀母猪四个不同生长阶段的猪粪便进行实验研究。

在本实验中，耐药细菌的分布在养猪场各生长阶段猪粪中存在明显的差异，幼龄阶段的仔猪粪便中耐药细菌的比例高于成猪粪便。造成这种差异的原因可能与该养殖场对不同生长阶段猪抗生素的使用量以及不同生长阶段猪对药物的代谢能力等有关。多项研究表明粪便中抗生素的残留会导致耐药细菌的产生，为了明确产生这种差异的原因，还需要对粪便中抗生素的残留进行进一步研究。

本实验选择四环素和头孢氨苄两种抗生素进行耐药细菌数量研究，发现在养猪场各生长阶段的粪便中，耐头孢氨苄的耐药细菌比例几乎都高于四环素，分别达到37.33%、71.52%、82.78%、40.27%。头孢氨苄属于β-内酰胺类抗生素，是人兽共用的广谱类抗生素。这类抗生素比较容易诱导产生抗性，而且其诱导产生的耐药基因可以在人群中、动物群中、生态系统中的细菌间相互传递。例如河北省肉牛源溶血性大肠埃希菌有23株对头孢氨苄耐药性高。东北地区鹿源大肠杆菌对22种抗生素具有复杂的耐药性，其中对头孢噻吩的耐药性超过90%。另有报道，意大利猪肉生产线上的猪肉样品中，63.60%的葡萄球菌携带对β-内酰胺抗性的 blaZ 基因。本实验中，对四环素和头孢氨苄产生双重耐药性的耐药细菌主要分布在断奶仔猪粪便中。原因可能是仔猪正处于从哺乳到断奶的过渡时期，该阶段是仔猪快速生长期以及哺乳到断奶过度时期,容易受外界的各种变化而产生应激时期。因此需要同时使用防病和促生长多种抗生素，而随着仔猪年龄的增加，抗生素的使用量和使用种类也会随之减少。目前，对畜禽粪便中多重耐药细菌的研究较少，主要涉及耐药菌株的耐药特征研究。如唐伟欣等对畜禽粪便和有机肥中多重耐药细菌的耐药性进行了研究，发现禽畜粪便中多耐药菌的菌门集中分布在Proteobacteria、Firmicutes和Actinobacteria，多重耐药菌的优势菌属为Escherichia、Corynebacterium。检测出的多重耐药菌都对红霉素、四环素有着较高的耐药性，均高于80%。刘宗保从养猪场和猪肉样品中分离出102株多重耐药菌株，其中最常见的是大肠杆菌(Escherichia coli)，其次为柠檬酸杆菌(Citrobacter sp.)、克雷伯氏菌(Klebsiella sp.)以及志贺氏菌(Shigella sp.)，且药敏检测结果显示磺胺类、四环素类、氨基糖苷类、β-酰胺类等抗生素耐药基因分布最广。

4 结论

(1)根据抗性细菌检测结果可以看出，断奶仔猪粪便中四环素耐药细菌所占比例最大，育肥猪粪便中头孢耐药细菌占比最大,而双重耐药细菌主要存在于幼龄仔猪粪便中。(2)在养猪场各生长阶段的猪粪便中，相比较于四环素，抗头孢氨苄的耐药细菌比例都明显最高。(3)养猪场幼龄期猪粪便中单一耐药细菌及多重耐药细菌的比例高于成年期，这与幼龄期抗生素使用量和使用种类有关。