基于微流控技术的呼吸道病毒可视化免疫检测研究

潘 婷 吴力强 钱纯亘 聂立波

1.湖南工业大学 生命科学与化学学院 湖南 株洲 412007

2.深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司 平台预研部 广东 深圳 518100

1 研究背景

呼吸道病毒是指一大类以呼吸道为侵入门户，引起呼吸道或呼吸道以外器官病变的病毒。急性呼吸道感染（acute respiratory infection，ARI）是世界范围内，引发急性病和致死性疾病的主要病因之一[1]。全球每年大约有400万人因感染呼吸道病毒而死亡[2]。5岁以下儿童中，全球每年仅流感和呼吸道合胞病毒感染，导致的总死亡人数达30万人以上[3]。

2019年末至2020年初，一种新型冠状病毒2019-nCoV（即SARS-CoV-2）的人际传播，导致了疫情爆发。世界卫生组织（WHO）统计数据显示，截至2021年9月，全球累计确诊病例超过2.3亿，累计死亡人数达470多万。

急性呼吸道感染中，90%以上由病毒引起[4]。常见的引发急性呼吸道感染的病原体有：冠状病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒、人腺病毒和鼻病毒等[5]。大多数呼吸道病毒具有感染力强、传播快、潜伏期短、发病急等特点[6]。呼吸道病毒种类繁多，且感染后症状较为相似，因此诊断区分十分困难[7-9]。快速准确的检测对阻断疾病传播起着至关重要作用[10-15]。

呼吸道病毒临床检测方法主要包括快速抗原检测和核酸扩增检测[16]。目前，新型冠状病毒肺炎的检测通常要用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）分析仪，在专业实验室中进行，同时需要专业人员操作，这限制了医疗条件简陋的偏远地区及护理点检测的可行性[17-21]。微流控技术的快速发展，为开发成本低、用户友好的呼吸道病毒监测平台提供了新的策略。微流控芯片在微小尺度上实现流体的操控，构建出芯片实验室模型，从而将多种化学和生物学的过程集成到微全分析系统中[22-24]。微流控芯片能实现操作过程的自动化、检测目标的高通量和试剂的低消耗，还能与其他技术设备集成和兼容[25]。微流控芯片因具有试剂用量少、反应过程短、灵敏度高、成本低等优点，可广泛应用于化学、生物、物理、医学等自然科学领域[26-30]。

金纳米颗粒（gold nanoparticles，AuNPs）因其独特的物理和光学性质，已广泛用于病毒以及其他病原体和疾病的检测[31]。金纳米粒子具有可视化显色特性，在基于微流控技术的诊断设备开发中具有广泛的应用前景[32]。侧向流动法是最常用的基于AuNPs的体外诊断护理点检测方式，其操作简便且无需昂贵设备[33]。

Xia Y. Q. 等[34]开发了一种用于禽流感病毒检测的微流控传感器，该传感器以人字形聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）芯片为载体，在氧化锌纳米棒三维结构上包覆HA特异性抗体。捕获的病毒进一步用抗体包被的Au-Ag核壳纳米粒子标记。肉眼目测的检出限为2.7×104EID50/mL，比常规基于荧光的酶联免疫吸附测定 （enzyme-liked immuno sorbent assay，ELISA）法低一个数量级。用智能手机成像系统进行比色检测，其检出限可低至8×103EID50/mL，病毒捕获和检测过程可在1.5 h内完成。

基于上述背景，本研究开发了一种压力驱动的微流控芯片，以实现快速、直观地检测甲型流感病毒（influenza A virus，FluA）、乙型流感病毒（influenza B virus，FluB）、呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）、新型冠状病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）。

2 实验

2.1 主要实验材料与仪器设备

1）实验材料

H1N1流感抗原（病毒培养物总蛋白质量浓度1.88 mg/mL）、B流感抗原（病毒培养物总蛋白质量浓度3.56 mg/mL）、FluA抗体、FluB抗体、RSV抗体、GAM-IgG、SARS-CoV-2抗体，广东菲鹏生物股份有限公司；SARS-CoV-2抗原，深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司；RSV 抗体，Hytest公司；氯化金(III)水合物、trizma®base,美国Sigma-Aldrich公司；牛血清白蛋白，新西兰Proliant公司；氯化钠、柠檬酸三钠、氢氧化钠、碳酸钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钾，上海国药集团化学试剂有限公司；硝酸纤维素膜，德国Merck公司；聚甲基丙烯酸甲酯（polymethyl methacrylate，PMMA）板材，成都世化亚克力科技有限公司；医疗双面胶，美国3M公司。

2）仪器设备

激光雕刻机，VLS3.50型，美国Universal Laser Systems公司；真空热压机，TBS-200型，浙江扬清芯片技术有限公司；电热鼓风干燥箱，DHG-9140(A)型，上海一恒科学仪器有限公司；多功能酶标仪，Synergy LX型，美国BioTek公司；微量注射泵，Pump 11 Elite型，美国Harvard Apparatus公司；场发射透射电子显微镜，JEM-F200型，日本电子株式会社；激光共聚焦显微镜，DCM8型，德国Leica公司；涡旋混合仪，VX-200型，美国Labnet公司；数控定时超声波清洗机，040S型，深圳市洁盟清洗设备有限公司；高速冷冻离心机，5804R型，德国Eppendorf公司；磁力搅拌器，PC-620D型，美国Corning公司。

2.2 实验方法

2.2.1 检测原理

基于微流控技术的可视化呼吸道病毒免疫检测原理如图1所示。

图1 基于微流控技术的可视化呼吸道病毒免疫检测原理图Fig. 1 Schematic diagram of visual immunoassay of respiratory virus based on microfluidic technology

待检测抗原经加样口注入芯片，首先与包被溶解区的胶体金标记抗体反应，在混合区进一步充分混合形成抗原抗体复合物后，流经检测区，捕获抗体与抗原进行特异性识别，形成抗体-抗原-抗体夹心结构，并在检测区聚集。胶体金为颜色型标记材料，聚集后产生明显的显色反应，通过微流控芯片检测区检测线颜色的有无，进行样本中检测目标物的判定。

2.2.2 胶体金的制备

胶体金的制备采用柠檬酸三钠还原法。具体制备过程如下：将250 mL去离子水放入洁净的玻璃器皿中，并置于可加热磁力搅拌器上加热至沸腾，然后加入质量分数为2%的柠檬酸三钠溶液2.25 mL；当溶液再次沸腾后，迅速加入质量分数为1%的氯金酸溶液2.5 mL，溶液颜色变为酒红色，继续加热煮沸5 min；冷却至室温后用去离子水补足至原体积；将制备好的胶体金溶液室温避光保存。

2.2.3 胶体金标记抗体最佳pH条件优化

向盛有1 mL胶体金的各试管中分别加入0, 3,6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30 μL浓度为0.2 mol/L的K2CO3溶液，混匀，得到一系列不同pH梯度的胶体金溶液。待pH值稳定后，向每管中分别加入质量浓度为1 mg/mL的相应抗体10 μL，并颠倒混匀。4 ℃下静置过夜观察胶体金状态，并进行紫外可见光谱（UV-Vis）检测，不稳定的胶体金呈现出由红变蓝的聚沉现象。将使胶体金稳定的0.2 mol/L K2CO3溶液最低用量作为对应的胶体金标记抗体最佳条件，测出该条件下溶液的pH值，即为最佳标记pH值。

2.2.4 标记最佳抗体用量优化

在胶体金与抗体偶联过程中，适当的抗体用量是保证检测灵敏度及控制抗体用量成本的关键。因此对胶体金标记抗体的最佳用量进行优化。

取10 mL制备好的粒径均一的胶体金，滴加0.2 mol/L K2CO3溶液调节胶体金溶液的pH值至最佳标记pH值。然后将此胶体金溶液分装入1.5 mL的离心管中，每管1 mL，各管中分别加入FluA、FluB、RSV抗体的量均依次为0, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12 μg，SARS-CoV-2抗体加入量依次为0, 3, 6, 9, 12, 15, 18,21 μg，振荡混匀后，室温孵育l0 min。最后，每管取出200 μL并加入质量分数为10%的NaCl溶液20 μL，混合均匀后室温孵育2 h，观察离心管中胶体金溶液的颜色变化情况，并进行UV-Vis检测，从而确定最佳抗体用量。

2.2.5 胶体金标记抗体表征

根据实验得出的胶体金标记抗体最佳条件，分别对本研究中呼吸道病毒检测项目的抗体进行标记。为了评估标记效果，用紫外可见光谱和透射电子显微镜，对经标记及纯化后的胶体金标记抗体进行检测和表征。

2.2.6 芯片的设计与制作

采用AutoCAD软件进行芯片设计。单通道微流控芯片由底板、废液腔层、通道层和盖片组成，如图2所示。通道层由进样口、包被溶解区、混合区、检测区构成。盖片为一矩形光板，其上开有两个孔，分别为注液孔和排气孔。底板、废液腔层、通道层和盖片键合形成了密闭微通道，构成芯片的功能区域。

图2 微流控芯片的设计结构Fig. 2 Design structure of the microfluidic chip

选用聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）为基材，根据设计图（见图2b），用激光雕刻机加工。其中通道层、废液腔层、底板厚度均为0.3 mm，盖片厚度为0.1 mm。芯片组装工序如下：先将通道层上下底面贴双面胶，废液腔层下底面贴双面胶，接着将芯片的底板与废液腔层贴合，用真空热压机进行热压键合，并对其上表面进行亲水处理。在处理好的芯片上表面粘贴通道层，将玻纤切割后嵌入包被溶解区，以其作为载体，滴加胶体金标记抗体。在检测区嵌入经激光切割好的硝酸纤维素膜（nitrocellulose membrane，NC膜），膜上包被有两条捕获抗体线，质控线为GAMIgG（C线），检测线为对应呼吸道病毒的包被抗体（T线）。胶体金标记抗体进行干化处理后，再将盖片贴至上层，真空热压键合，制得完整的测试芯片。

2.2.7 呼吸道病毒检测

采用自制微流控芯片，分别对甲型流感H1N1灭活病毒、乙型流感灭活病毒、呼吸道合胞病毒标准抗原、新型冠状病毒标准抗原进行检测。将配置好的80 μL抗原检测样本用注射泵通过加样口注入芯片，流速为8 μL/min，反应10 min，直至结果稳定，进行结果读取。

2.2.8 信号采集与处理

信号可通过肉眼可视化检测。但是，为了科学评估微流控免疫芯片的检测性能，本研究先利用智能手机对检测结果进行拍照，再用Image J软件提取图像光密度值，最后用Origin 2019b软件处理数据，得到拟合曲线。

3 结果与讨论

3.1 胶体金的表征

用多功能酶标仪对所制备的胶体金进行UV-Vis检测，并用透射电子显微镜对其形貌及分散性进行表征，结果如图3 所示。由图3可知，胶体金的最大吸收峰位于520 nm处，其粒径大小为（19.73±1.20）nm，且分散均一性良好。

图3 胶体金的表征Fig. 3 Characterization of AuNPs

3.2 胶体金标记抗体最佳pH条件

采用柠檬酸三钠还原法制备的胶体金表面带有大量负电荷，胶体金对蛋白质的吸附主要取决于pH值。当胶体金悬浊液PH值接近蛋白质等电点或稍偏碱性时，二者容易形成牢固的结合物。本研究对胶体金标记抗体的最适pH值进行了条件优化，实验结果如图4所示。

图4 胶体金标记不同抗体的pH条件优化Fig. 4 Optimization of pH values of different antibodies labeled with AuNPs

由图4可知，随着K2CO3溶液加入量的增加，即pH的升高，胶体金颜色由紫变红并趋于稳定。将使1 mL胶体金稳定的最低K2CO3溶液加入量作为最佳标记条件，结果是FluA、FluB、RSV和SARSCoV-2抗体标记的最佳K2CO3溶液加入量分别为9,12, 12, 6 μL，对应的pH值分别为7.7, 8.1, 8.2, 7.2。

3.3 标记抗体最佳用量

蛋白质用量影响胶体金与蛋白质结合的稳定性。为达到理想标记效果，本研究对胶体金标记抗体的最适用量进行了条件优化，实验结果如图5所示。由图5可知，随着抗体用量的增加，胶体金由蓝变红并趋于稳定。选取能使胶体金稳定的最低抗体用量为标记最佳抗体用量，结果是每1 mL胶体金中FluA、FluB、RSV和SARS-CoV-2抗体的最佳用量分别为4,4, 4, 15 μg。实际应用中为达到更好的结合效率，在此基础上增加5%～10%的抗体用量。

图5 不同病毒标记抗体的用量优化Fig. 5 Optimization of antibody amounts of different viruses

彩图

3.4 胶体金标记抗体结果表征

根据最佳标记pH及标记抗体最佳用量，进行了抗体小样标记，并对标记后的胶体金与抗体偶合物进行了UV-Vis检测，结果如图6所示。

图6 胶体金标记抗体的UV-Vis光谱图Fig. 6 UV-Vis spectra of AuNPs -labeled antibodies

由图6可知，胶体金的最大吸收峰波长为520 nm，胶体金标记抗体的最大吸收峰波长为524 nm，表明抗体与胶体金成功偶联。

对标记后的偶合物进行透射电镜表征，结果如图7所示。由图7可知，标记后粒径为（21.31±1.50）nm，比裸胶体金的粒径略有增加，粒径均一，且分散性好。

图7 胶体金标记抗体的表征Fig. 7 Characterization of AuNPs-labeled antibody

3.5 检测灵敏度

采用本研究制作的芯片分别对FluA、FluB、RSV、SARS-CoV-2 4种呼吸道病毒进行抗原浓度梯度检测，每个浓度进行3次重复测试，采用Image J软件对检测结果进行光密度值提取，并计算出平均光密度值，结果如图8所示。

图8 不同病毒抗原浓度的检测结果Fig. 8 Detection results of different antigen concentrations of viruses

彩图

由图8可知，肉眼可见胶体金的颜色随着抗原质量浓度的降低而变浅， 阴性则无反应现象。实验组的平均光密度明显高于阴性对照组的，说明芯片可实现对4种病毒的检出。当FluA抗原质量浓度为37.6 ng/mL时，可检出信号，而当质量浓度为18.8 ng/mL时，无检测信号，即检出限为37.6 ng/mL。同样可得，芯片对FluB检出限为17.8 μg/mL，对RSV标准抗原和SARS-CoV-2标准抗原检出限分别112.5 ng/mL和0.05 ng/mL。此外，本检测从进样到显色，直至显色结果稳定，总检出时间为10 min。

3.6 检测特异性

为了验证微流控芯片的检测特异性，配制不同浓度抗原，每个浓度进行3次重复测试，结果如图9所示。FluA灭活病毒、FluB灭活病毒、RSV标准抗原、SARS-CoV-2标准抗原的质量浓度分别为9.4 μg/mL, 178.0 μg/mL, 900.0 ng/mL, 2.5 ng/mL。

图9 不同病毒的检测特异性Fig. 9 Detection specificity of different respiratory viruses

彩图

由图9可知，病毒特异性检测以其他3种病毒作为干扰物，每种病毒的检测线只有相应病毒出现信号，其他3种干扰病毒无信号，说明不同检测项目之间无相互干扰，特异性良好。

4 结语

本研究以微流控芯片为载体，实现了呼吸道病毒可视化免疫检测。通过芯片设计将进样区、包被溶解区、混合区、检测区集成在微流控芯片上。芯片结构的设计中引入蛇形混合区，通过对流体流速的控制使目标物与包被抗体能更加充分地反应，提高检测的灵敏度。以注射泵作为流体驱动力，通过精准的流体控制实现了甲型流感H1N1、乙型流感灭活病毒、呼吸道合胞病毒、新型冠状病毒标准抗原的可视化检出，总检出时间为10 min，单次所消耗样本量为80 µL。所研制的免疫微流控芯片具有特异性高、样品量少、操作简便、检测快速、无交叉反应等特点。

相较于传统的免疫学检测试纸，本研究中微流控芯片的制备步骤相对较多，但这仅限于实验室制备，工业生产时可采用注塑成型法替代，以便于快速大批量制备，降低成本。对于传染性病原体的检测，集成式的芯片提供相对封闭的检测环境，可有效防止疾病的扩散。在后续研究中，可通过微流控芯片结构的设计实现多项目的联合检测，提高筛查效率；还可开发简易的自动化集成设备，用于医疗资源相对缺乏地区疾病筛查及床旁快速检测。