花椒麻素对SD 大鼠肥胖模型脂代谢的影响
2022-05-13张晋森汪晟羽何金华江龙丰李玉锋
张晋森,兰 林,汪晟羽,吴 韬,何金华,苏 婷,江龙丰,李玉锋
(西华大学食品与生物工程学院,四川 成都 610039)
藤椒(Zanthoxylum armatum DC),又名竹叶花椒,在我国西南及周边地区广泛种植,具有良好的食药两用价值[1]。藤椒主要由挥发油、生物碱、酰胺类等多种化学物质构成[2],其中酰胺类成分是其主要麻味物质,又称为花椒麻素[3−4]。相关文献[5−7 ]表明,花椒麻素具有抑菌、降脂、祛风除湿、杀虫及镇痛等多种生物学活性。
心脑血管疾病是目前全世界范围内危害人类生命健康的首要威胁[8],其中冠心病占比达34 %[9],而由脂代谢紊乱引起的肥胖症、高脂血症是冠心病的主要诱因[10−12]。目前,有关脂代谢紊乱的研究[13−14]较多,但关于花椒麻素对体内脂代谢调节作用的报道偏少。本文旨在研究花椒麻素对肥胖症模型SD 大鼠体内脂质代谢功能的影响,为藤椒防治糖脂代谢性疾病的产业化开发提供依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物及饲料
SPF 级雄性SD 大鼠,8 周龄,体质量140~160 g,实验动物来自四川省达硕动物有限公司,实验动物生产许可证号SCXK(川)2020−030。饲喂用指定条件饲料和水,环境温度保持在18~26 ℃,相对湿度为30%~70%。所有的动物实验按照国家科技委员会指定的《实验动物管理条例》进行。
大鼠基础饲料配方:粗蛋白18.5%,粗脂肪5%,粗纤维3%,粗灰分5.5%,钙1%,总磷0.78%。高脂饲料配方:粗蛋白≥180 g/kg,粗脂肪≥40 g/kg,粗纤维≤50 g/kg,粗灰分≤80 g/kg,钙10~18 g/kg,总磷6~12 g/kg。材料由江苏协同医药生物工程有限责任公司提供。
1.2 主要试剂及设备
甘油三酯(triglyceride,TG)试剂盒、总胆固醇(total cholesterol,TC)试剂盒、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)试剂盒、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)试剂盒由上海科顺生物提供;非诺贝特由成都化夏化学试剂有限公司提供;花椒麻素样品(藤椒原料)由四川省巴中市平昌县藤椒种植示范基地提供。提取方法参照罗凯等[15]的方法并略作修改。
主要仪器与设备:移液器Finnpipette;洗板机Tianshi;酶标仪Rayto,型号RT-6100。微量高速离心机(国产),仪器型号TG16W;台式高速冷冻离心机,型号TGL16M;恒温摇床,型号HT-111B;电子分析天平,型号AE1204(国产);电子分析天平,型号XB220A;81-2 恒温磁力搅拌器;EasyWeLL 系列细胞破碎仪,型号JY98-IIIN;台式高速冷冻离心机Therm 公司,型号ST16R;日本SANYO,型号MDFU32V 超低温冰箱;电子天平,型号YP601N。
1.3 实验方法
1.3.1 主要试剂的配制
将用于灌胃的花椒麻素样品与食用大豆油按照1 mL/100 g 大鼠体质量灌胃量剂量配制成1 mg/mL的花椒麻素溶液。将非诺贝特按照20 mg/mL 的剂量与大豆油配制成非诺贝特溶液。
1.3.2 动物造模与实验
选取48 只体质量均为140~160 g 的8 周龄的健康雄性SD 大鼠饲养在通风良好,室温(24±1)℃,相对湿度48%~58%,12 h/12 h 模拟光照交替的环境中,自由采食。适应性喂养一周后,将体质量相近大鼠随机分为6 组。分别为普通饲料对照组(BC 组)、高脂饲料模型组(MC 组)、花椒麻素低/中/高剂量组(LD/MD/HD 组)、非诺贝特阳性对照组(AC 组)。BC 组基础饲料喂养,余下所有组别均采用高脂饮食。每日下午13:10~14:10 对低、中、高剂量组大鼠按剂量灌胃4/8/12 mg/(kg∙BW)经大豆油混合的花椒麻素,BC 组和MC 组大鼠灌胃等量的大豆油,AC 组使用非诺贝特溶解液按照40 mg/(kg∙ BW)剂量灌胃,灌胃6 周。
1.3.3 样品收集与前处理
实验开始至第6 周结束,大鼠通过摘取眼球收集血液后脊椎脱臼处死,将血液收集于装有抗凝剂的采血管中,并立即在4 ℃、4 000 r/min 条件下离心15 min,将血清提取收集于离心试管中并置于−78 ℃冰箱保存。完成血液采集后,解剖大鼠,取出大鼠肝脏并使用低温生理盐水冲洗,洗去表面血水后擦拭除去表面水渍,精密称取肝脏总质量,取1.5~2.5 g 肝脏放入样品袋贮存于−78 ℃冰箱中留样。
1.3.4 指标测定
1.3.4.1 饲料效率的测定
记录大鼠的初质量、末质量及采食量,计算实验动物饲料效率。
1.3.4.2 血脂指标的测定
将1.3.3 分离得到的血浆置于冰上,待完全解冻后,按照相关试剂盒操作说明,采用双抗体夹心法测定标本中大鼠血脂指标水平,通过标准曲线计算样品中TG、TC、LDL-C 及HDL-C 含量。按照Cai 等[16−17]的方法,计算测定大鼠血脂综合指数(LCI)与动脉粥样硬化指数(AI)。
1.3.4.3 肝脏指标的测定
肝脏中总脂含量采用Folch 等[18]的方法进行测定。本文按照相关试剂盒操作说明测定肝脏中甘油三酯(TG)和总胆固醇(TC)的含量。
1.3.5 数据分析
所有数据以mean±SD 的形式表示,数据采用one-way ANOVA 分析,组间比较采用t 检验,P<0.05 表示有显著性差异,统计学软件使用IBM SPSS Statistics 26。
2 结果与讨论
2.1 花椒麻素对大鼠体质量、采食量及饲料效率的影响
实验造模共用7 周,实验过程中,大鼠毛色光滑,活动正常,生长正常,无死亡及活动病态等现象。初始各组大鼠初始体质量相近,个体差异小。各组大鼠体质量随实验周期的进行,逐渐增加,符合其正常生长规律。模型组质量变化显著高于普通饲料组(P<0.05)。实验结束时,MC 组大鼠体质量显著超过BC 组,说明长时间高脂饮食对大鼠体质量有显著的促进作用。在对大鼠分别使用不同剂量的花椒麻素过后,大鼠体质量增长趋势逐渐变慢。与MC 组相比,分别采用低中高不同剂量的花椒麻素饲喂较长时间后,大鼠增重趋势缓和,但体质量无显著差异(P<0.05)。
表1 中,相较于BC 组,MC 组采食量下降,饲料效率显著上升(P<0.05),这与高脂饲料中的配方有关。高脂膳食有大量脂肪蛋白,容易引起大鼠获得饱腹感,进而采食减少。BC 组采食量最高,采食效率最低。AC 组采食效率最接近BC 组,采食量最低,平均增重最少。相比于MC 组,饲喂低剂量花椒麻素对LD 组采食量影响不明显,但MD 组、HD组大鼠采食效率随花椒麻素剂量的提升增重减少,饲料效率降低(P<0.05)。
表1 花椒麻素对采食量、体重变化量和饲料效率的影响
相比MC 组大鼠,AC 组大鼠与各剂量组大鼠的采食效率均显著减少,AC组大鼠采食量相对减少而花椒麻素组大鼠采食量显著增加,并且与花椒麻素剂量呈正相关。同时,LD 组、MD 组、HD 组平均增重呈逐渐下降趋势,证明花椒麻素具有促进饮食与抑制大鼠体质量的作用,花椒麻素在实验过程中对于体质量与采食量,呈现剂量依赖关系。
2.2 花椒麻素对大鼠血脂的影响
花椒麻素对试验大鼠血脂影响如表2 所示,高脂饮食使大鼠的血脂水平显著升高。其中血清总胆固醇水平升高幅度较甘油三酯更大,成功形成了肥胖模型。由表2 可知,实验结束时,相对于空白对照组(BC),高脂模型组(MC)中TC、TG 含量明显增加,HDL-C 显著降低、LDL-C 显著上升,说明肥胖模型造模效果显著。花椒麻素低、中、高剂量组TC 水平相对于高脂模型组(MC)分别降低了17.1%、30.84%、26.8% (P<0.05),TG 水平相对于高脂模型组(MC)分别降低了7.8%、19.03%、26.22%(P<0.05)。相对于MC 组,花椒麻素低、中、高剂量组HDL-C 水平相对增加了2.8%、8.8%、14%,LDL-C水平相对减少5.8%、16.5%、25.7% 。这项实验结果说明,花椒麻素对大鼠肥胖症状有缓解作用,对调节胆固醇代谢效果较好,且与剂量成正相关,这与前人的研究[19]结果一致。
表2 花椒麻素对血脂的影响
LCI 和AI 分别反映了高脂血症的可能性与动脉硬化的趋向性。LCI 值证明,大鼠高脂血症趋势得到有效缓解。与对照组(BC)相比,MC 组大鼠AI 显著上升70%(P<0.05)。相对于高脂模型组(MC),长期灌胃低、中、高剂量花椒麻素的LD组、MD 组、HD 组,其 AI 值分别下降了4.47%、19.07%和29.68%(P<0.05),其中,中、高剂量组效果显著。这说明花椒麻素对于由高脂饮食引起的代谢疾病有缓解作用,并且在范围内呈现出剂量依赖关系;因此,长期摄入含花椒麻素的食物可能有助于预防与肥胖与脂代谢相关的部分慢性疾病。
2.3 花椒麻素对大鼠肝质量及肝脏指数的影响
由表3 可知,相同周龄的MC 组大鼠肝质量显著高于BC 组。HD、AC 两组肝脏指数均显著低于MC,且其余各高脂组与MC 在肝脏指数上无显著差异。LD 组、MD 组、HD 组大鼠肝脏指数随着花椒麻素单位剂量浓度升高而逐渐降低,说明高剂量的花椒麻素与非诺类阳性药物对大鼠肝脏脂肪代谢有积极作用。
表3 花椒麻素对肝脏指数的影响
在Wang 等[20]的研究中发现,肝脏组织病理结构显示,花椒烷基酰胺治疗使肝脏脂肪变性减轻,高剂量组效果尤为明显。此外有研究[21−23]证明花椒麻素能显著提高大鼠肝脏中TRPV1 受体的表达,而TRPV1 受体与心血管疾病的发生密切相关,同时也在脂代谢中起到重要作用。花椒麻素通过激活肝脏组织中的TRPV1 受体提高LXRcx、ABCA1 和ABCG1的表达水平,可有效防止小鼠血管脂质积累和动脉粥样硬化[24−26]。因此,可根据实验结果假设花椒麻素通过干涉肝脏表达影响SD大鼠的代谢平衡。
2.4 花椒麻素对大鼠肝脂的影响
花椒麻素对高脂膳食大鼠肝脂的影响见表4。与BC 组相比,MC 组肝脂浓度、总脂、TC 以及TG分别增加了27.51%、89.85%、100.00%和 147.12%,通过高脂饮食,肝部脂类含量明显增多。随着花椒麻素单位剂量的逐渐增加,大鼠肝脂含量逐渐降低,表明花椒麻素显著降低了TC、TG 及总脂的浓度,且表现出显著的剂量效应关系。其中,HD 相对于MC 其总脂、TC 以及TG 分别下降了29.66%、16.74%和43.78% (P<0.05),说明花椒麻素对于由长期高脂膳食引起的肥胖与肝脏脂肪蓄积有缓解作用。
表4 花椒麻素对肝脏脂质的影响
3 结论
经过高脂膳食造模培养,大鼠血清中甘油三酯、胆固醇与低密度脂蛋白胆固醇含量指标增长明显,高密度脂蛋白胆固醇浓度降低,同时在肝脏中甘油三酯与胆固醇浓度呈现同样的上升趋势,符合研究预期结果。在长期饲喂不同剂量的花椒麻素后,各剂量组饲料效率降低,血脂综合指数降低,动脉粥样化趋势缓解,同时在抑制肝脏脂肪蓄积与胆固醇调节方面也呈现出不错的剂量效应关系。结果表明花椒麻素具备调节平衡大鼠脂代谢方面的功能。由于花椒麻素影响脂代谢的机制尚不明确完善,在代谢酶、基因表达及微生物方面的作用方式亟待探索,后续将采用病理学检查、16SDNA 测序、代谢组学、转录组学等多种方式进—步探明花椒麻素对SD 高脂膳食大鼠脂代谢及健康的影响机制。