超高效液相色谱串联质谱法鉴定皮革的动物源属性

杜业刚，刘奕雄，王韦达，朱雨田，郑燕燕

（深圳市计量质量检测研究院，国家营养食品质量检验检测中心（广东），广东 深圳 518102）

引言

天然皮革，一般是以动物生皮为主要原料，经脱毛脱脂、碱处理、酸水解、鞣制和染 色 等工序加工制成，其种类繁多，有哺乳动物类、爬行类、两栖动物类皮革等，其中猪、牛、羊皮革是最 常 见 的三大皮种。天然皮革制品的优良性能深受广大消费者的钟爱，在箱包、衣服、鞋具、手套、家居等产品中应用广泛，市场需求量巨大，全球每年贸易额超过 1000 亿美元。随着加工工艺水平的提高，使得市场上以假乱真、以次充好，以人造革冒充天然皮革，以低价种类皮革冒充高价种类皮革等现象屡见不鲜。因此，鉴定皮革的物种属性一直以来都是皮革和纺织业研究和关注的重点方向之一[1-2]。目前鉴定皮革种类的方法主要有传统感官法、红外光谱法、聚合酶链式反应（PCR）法和质谱法。感官经验法[3-4]主要是借助放大镜或显微镜等辅助设备，依靠眼看手摸，通过对皮质的毛孔、纹理、手感等进行综合性评价分析来进行辨别。该法主观性强，经验要求高，而且先进的加工水平使得通过传统感官法难以应对。红外光谱法[5-7]将皮革表面的涂饰层去除后，根据不同种类的皮革在红外区特征吸收的指纹图谱中细微差别来进行甄别。红外光谱法能有效区分人造革和天然皮革，但是天然皮革之间的红外光谱吸收有交叉，因此红外光谱法较难区分天然皮革的动物种类。分子生物学手段[8-10]是先提取皮革中动物物种的 DNA，然后采用PCR 技术对特征 DNA 进行扩增来判断其物种属性，方法灵敏度高，特异性强。但是皮革在鞣制加工过程中的酸碱处理会降解 DNA，鞣剂使 DNA 与蛋白质交联增加了分离难度，重金属对酶的影响会抑制 PCR 扩增，这些问题都限制了 PCR 方法的应用。质谱技术在物种属性鉴别领域的应用是近年来的研究热点[11-15]。动物皮革富含胶原蛋白，经胰蛋白酶酶解后，利用质谱筛选出物种胶原蛋白特征肽段，基于不同物种热稳定性好的特征肽段，通过 UPLC-MS/MS 法能成功鉴定经过加热等处理过的动物物种属性。本研究根据筛选出猪皮、牛皮和羊皮的特征肽段，建立了鉴别皮革动物属性的多离子反应监测（MRM）UPLC-MS/MS 方法。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Acquity UPLC 液相系统 （美国 Waters 公司）；QTRAP 5500 三重四极杆 - 线性离子阱复合质谱仪（美国 SCIEX 公司）；Heraeus Fresco 21 型冷冻离心机（美国 Thermo Fisher Scientific 公司）；3-30K 型高速冷冻离心机 （德国 Eppendorf 公司）；DKZ-2 型电热恒温震荡水槽 （上海精宏实验设备有限公司）；HV-110 型自动高压灭菌器（日本 Hirayama 公司）；BC-1000 涡旋振荡器 （深圳逗点生物技术有限公司）；CAP224S 型万分位分析天平（德国 Sartorius 公司）；1.5 mL 低蛋白吸附离心管 （德国 Eppendorf 公司）；10000MWCO HY 超滤离心管（德国 Sartorius 公司）；ABI 7500 实时荧光 PCR 仪 （新加坡 Life Technologies）。

碳酸氢铵（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；测序级修饰胰蛋白酶（porcine，美国 Promega 公司）；乙 腈（色 谱 纯 ，德 国 Merck 公 司）；甲 酸（质 谱纯，美国 Thermo Fisher 公司）；实验用水均为一级水；蛋白酶 K、Taq 酶及 2×premix Extaq 酶（宝生物工程（大连）有限公司）；引物及探针（上海生工生物工程技术服务有限公司）。

1.2 UPLC-MS/MS 法条件

1.2.1 样品前处理

皮革样品剪成约 2 mm×2 mm 块状大小，备用。称取 1 g 样品于具塞玻璃管中，加入 4 mL 水，于高压灭菌器中处理 15 min（0.1 MPa，121 ℃），冷却至室温。将提取液移至离心管中，12 000 r/min 离心 15 min。移取上清液 200 μL 至蛋白超滤管中，14 000 r/min 离心 30 min。加入 100 μL 碳酸氢铵溶液（50 mmol/L）至蛋白超滤管，14 000 r/min 离心 30 min，弃去滤液，重复上述操作 2 次。更换接收杯，再加入100 μL 碳酸氢铵溶液（50 mmol/L）至蛋白超滤管上，并加入 20 μg/100 μL 的胰蛋白酶 10 μL 混匀，置于37 ℃水浴锅中酶解 16 h。将蛋白超滤管于 14 000 r/min 离心 35 min，收集滤液，待测。

1.2.2 色谱条件

色谱柱：Agilent Eclipse Plus C18 （2.1 mm×100 mm，1.8 μm），柱温：35 ℃，进样量 4 μL，流动相 A为 0.1%甲酸水，B 为乙腈，流速 0.300 mL/min，梯度洗脱程序：0～5 min，5%～15% B；5～6 min，15%～85%B；6～8 min，85% B；(8～9) min，85%～5%B；9～12 min，5% B。

1.2.3 质谱条件

多反应离子监测（MRM），电喷雾正离子模式扫描（ESI+），喷雾电压为 5500 V，离子源温度 550 ℃，气帘气 40 psi，雾化气 55 psi，辅助气 55 psi，离子对相关信息见表 1。

表1 特征肽段的 MRM 相关参数信息Tab. 1 MRM parameters of peptide markers

1.3 感官鉴定法

感官鉴定法采用现 有 广 东省 地 方 标准 方 法：DB44/T 1358-2014《天然皮革材质鉴别方法》。

1.4 PCR法

PCR 检测方法采用赖心田等[9]研制的荧光 PCR法。

2 结果与讨论

2.1 物种特征肽段的筛选

本研究中猪牛羊皮特征肽段的筛选方法与本课题组在之前发表的论文[16]中保持一致，所筛选出的特征肽段都经 Blast 分析确认，并进行了特异性验证，且实验证明所选取的肽段耐高温高压，在酸碱等严苛环境条件下仍能稳定存在，适用于天然皮革动物源属性的鉴定，具体肽段信息见表 1。

2.2 方法应用

利 用 建 立 的 猪 牛 羊 皮 革 特 征 肽 段 的 UPLC-MS/MS 法对 26 批次皮革样品进行了检测，包括 7 批次标识羊成分皮样，17 批次标识牛成分皮样和 2 批次标识猪成分皮样，并与感官鉴定法和 PCR方法的检测结果进行了对比。

从表 2 的检测结果可见，感官鉴定法仅对其中的 6 批次皮料样品做出了有效鉴定，由于现代生产工艺水平的提高，以及感官法的局限，未能对其他样品进行区分。PCR 法鉴定出了 7 批次样品，与感官法检测出的数量相当，其他样品中未能有效提取出 DNA，不能得到 PCR 扩增结果，从而限制了方法的应用。液相色谱串联质谱法相比于感官鉴定法和 PCR 法则具有明显的优势，能对所有26 批次样品均进行有效的鉴定，不受皮革种类和工艺的影响，适用性更广。感官鉴定法和 PCR 法的鉴定结果与样品标识的成分一致，液相色谱串联质谱法检测结果有 25 批次都与样品标识成分保持相同，但发现有 1 批次标识为羊皮的半裙面料，实际只检测到牛皮的特征肽段，并未检测到羊皮的特征肽段（如图 1 所示）。分析原因可能为标识错误，也有可能由于羊皮面料价格明显高于牛皮面料，商家有意用廉价的牛皮来冒充高价的牛皮的疑似造假行为。而该批次问题样品，用传统的感官鉴定法和 PCR 法都未能有效地鉴别区分，说明本研究所开发的基于特征肽段的液相色谱串联质谱法更先进，结果更准确可靠。

图1 标识为羊皮的样品中特征肽段 MRM 图Fig.1 MRM chromatograms of peptide markers of a sample claimed to be sheep skin

表2 皮革样品检测结果汇总表Tab. 2 summary of leather test results

图2 真实羊皮特征肽段提取离子流图Fig.2 Extracted ion chromatograms of real sheep skin peptide marker

3 结论

应用基于物种特征肽段建立的液相色谱串联质谱鉴别方法对皮革实际样品进行了检测，实验表明该方法特异性强，准确可靠，重复性好，且不受生产工艺影响，能适用于市面上不同类型皮料物种属性的鉴定，为解决当前天然皮革物种属性难以鉴别的难题提供了新的技术手段，为市场监管提供技术支撑，有助于打击假冒伪劣皮革制品，促进行业健康有序发展，具有广阔的推广应用前景。本研究仅选取了最为常见的猪牛羊皮做为研究对象，未来可以继续扩大研究范围，比如建立兔、狐狸、雪貂等皮毛的鉴定方法，本研究可以为进一步的研究提供参考。