冬青卫矛LTR反转录转座子RT序列克隆及分析

贺诗琪，范付华，吴宇航，龙 蓉，王君荣，陈美吉

(1.贵州大学 贵州省森林资源与环境研究中心/贵州省高原山地林木培育重点实验室,贵州 贵阳 550025；2.贵州大学 林学院,贵州 贵阳 550025)

反转录转座子是一种可移动的遗传元件，可以引起物种特异性状变异，在植物基因组中广泛存在，反转录转座子的激活对植物基因组的不断进化有显著影响，是物种遗传多样性的一个重要因素。与DNA“剪切—粘贴”式的转座机制不同，反转录转座子以自身转录而成的RNA为中间体，通过编码的反转录酶反转录成DNA后插入基因组新位点，原位置成分并不会被切除，因此能够在基因组中不断的自我复制增加拷贝数从而影响基因的活性以及基因组的结构。反转录转座子在植物发育过程中通常是转录沉默的，在外界环境因素和内在生物因子的刺激下能够激发其转座功能，引起基因组结构变化甚至相应基因功能的变异。

反转录转座子分为LTR(long terminal repeats)反转录转座子和非LTR反转录转座子两大类。其中，LTR反转录转座子两类成员Ty1-与Ty3-在水稻、梨、桂花、苹果、梨、枇杷等植物中均有报道。冬青卫矛()种质资源丰富、随处可见，不仅具有经济、生态和观赏效益，更具有一定药用价值。目前，鲜见有关冬青卫矛LTR反转录转座子研究的报道。植物LTR反转录转座子可以采用同源序列克隆法获得大量Ty1-类与Ty3-类反转录转座子反转录酶(reverse transcriptase，RT)序列，因其多拷贝、高多态性等特点具有非常高的研究价值，为植物遗传进化提供了素材；RT序列的测定，不仅可以对植物转座子的多态性进行监测分析，还可以此设计分子标记对植物种质资源亲缘关系等进行分析。

本文利用LTR反转录转座子RT序列保守区简并引物克隆并分析冬青卫矛RT序列特点，揭示LTR反转录转座子RT序列在冬青卫矛基因组中的异质性，为植物反转录转座子在基因组进化关系中的研究提供依据，也为冬青卫矛分子标记的开发种质鉴定、遗传多样性评价等提供依据。

1 材料与方法

1.1 DNA的提取与检测

以采集的贵州冬青卫矛叶片为材料，利用DNA提取试剂盒(DNAsecure Plant Kit(DP320-03)，北京天根生化科技有限公司)提取冬青卫矛基因组DNA，通过琼脂糖凝胶(1%)电泳和超微量核酸蛋白测定仪(德国Implen，N60 Touch)检测其质量、浓度，并用缓冲液(TE)稀释提取的DNA直至浓度约为20 ng/μL，低温保存备用。

1.2 LTR反转录转座子RT序列的PCR扩增

冬青卫矛RT序列引物参照前人的设计，与本课题组克隆枇杷RT序列的引物和反应条件一致。Ty1-类RT上游引物为5’-ACNGCNTTYYTNCAYGG-3’，下游引物为5’-ARCATRTCRTCNACRTA-3’；Ty3-类RT上游引物为5’-AGMGRTATGTGYGTSGAYTAT-3’，下游引物为5’-CAMCCMRAAMWCACAMTT-3’；其中N表示A/G/C/T碱基，M表示A/C，R表示G/T，Y表示C/T，S表示C/G，W表示A/T碱基。PCR反应体系为10 μL，其中PCR MasterMix(北京天根生化科技有限公司)5 μL，模板DNA和引物各0.5 μL。PCR程序参照课题组罗昌斌等的研究。取3 μL的PCR扩增产物，琼脂糖凝胶电泳检测，用凝胶成像系统(美国Bio-Rad，ChemiDoc XRS+)观察并拍照保存。

1.3 PCR产物的回收、转化及测序

使用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(TIANgel Midi Purification Kit,DP209-02)回收纯化PCR产物，且通过超微量核酸蛋白测定仪检测其质量和浓度。使用TaKaRa pMD19-T Vector Cloning Kit试剂盒和DH5α Competent Cell感受态细胞将PCR产物进行连接和转化。取已转化的感受态细胞在37 ℃无菌环境中倒置培养12～16 h，通过PCR扩增筛选阳性克隆，摇菌过夜培养，提取质粒后测序。

1.4 RT序列生物信息学分析

过滤出RT序列测序结果中的质粒基因组序列后，将所获得的Ty1-与Ty3-类RT序列通过NCBI数据库查询、对比，Bioedit翻译为氨基酸序列且构建序列相似矩阵以除去完全重复序列。采用ClustalX软件进行氨基酸序列多重比对，MEGA7软件构建LTR反转录转座子RT序列的系统进化树。

2 结果与分析

2.1 冬青卫矛RT序列特征

采用PCR扩增，将特征片段回收、测序，再去除重复和短序列后，获得冬青卫矛LTR反转录转座子Ty1-类RT(EJT1)序列40条，Ty3-类RT(EJT3)序列39条，此次得到的序列与其他植物RT序列长度大致一样。序列长度、A/G比例及登录号见表1。

表1 冬青卫矛Ty1-copia与Ty3-gypsy类反转录转座子RT序列信息Tab.1 The information of RT sequences of LTR retrotransposon in E. japonicus

2.2 Ty1-copia类RT序列分析

本研究得到40条Ty1-类RT序列，长度范围为231～267 bp，其中AT所占的比例为48.85%～65.27%。核酸序列的相似性为8.05%～97.7%，平均相似性为40.2%，其中序列EJT1-5、EJT1-30与EJT1-2的相似性最高，为97.7%；序列EJT1-4与EJT 1-7的相似性最低，为8.05%。这表明冬青卫矛Ty1-类RT碱基序列差异较大，具有较高的异质性。利用MEGA7软件的最大似然法将克隆所得到的冬青卫矛Ty1-类反转录转座子RT序列进行系统进化分析，可将40条序列分为5类(图1)。其中第Ⅰ类有27条序列，第Ⅱ类有6条序列，第Ⅲ类仅有1条序列为EJT1-22，第Ⅳ类包含4条序列，第Ⅴ类有2条序列为EJT1-34和EJT1-45。第Ⅰ类所包含的序列条数最多且分散，而第Ⅲ类序列EJT1-22相较于其他类别中的序列的遗传距离较大。

注：树枝长度表示估算得到的遗传距离，树的分支处数值表示1000次重复的自展值(下同)。图1 冬青卫矛Ty1-copia-RT核酸序列进化树Fig.1 Phylogenetic tree of RT nucleotide sequences of Ty1-copia retrotransposons in E. japonicus

将所获得的 RT序列分别翻译为氨基酸序列，可以发现没有终止密码子突变。参照Ty1-类RT氨基酸的保守序列，发现多处移码突变。例如EJT1-37的50位氨基酸处；EJT1-19的5位氨基酸处；EJT1-3、EJT1-6、EJT1-12、EJT1-14等8条氨基酸序列的19位氨基酸处；EJT1-30、EJT1-31的24位氨基酸处等(图2)。

图2 冬青卫矛Ty1-copia-RT氨基酸(aa)序列多重比对分析Fig.2 The amino sequence alignment of RT of Ty1-copia retrotransposons in E. japonicus

从NCBI中下载已登录的来源于苹果(ABD76 543，)、枣(JQ003714，)、铁皮石斛(KJ147111，)、辣椒(JQ026381，)、李(AGX455 20，)、梨(JN639033，)、小麦(BAA02264，)等12条其他植物的Ty1-类反转录氨基酸序列，将它们与本文所得的冬青卫矛Ty1-类RT氨基酸序列进行多序列比较，构建相应系统进化树，可将所有序列分为4类(图3)。其中第Ⅰ类包含18条冬青卫矛Ty1-类RT序列，占所测序列的近一半，同时还有10条其他植物RT氨基酸序列在内，苹果、李、辣椒等三条序列比起其他序列与此次目标序列的遗传距离近，也说明他们的亲缘关系较近；第Ⅱ类有3条序列分别为EJT1-37、EJT1-38和EJT1-14，还包含有枣序列JQ003714，三者在进化关系中比较接近，聚为一类；第Ⅲ类仅有1条序列为EJT1-6；第Ⅳ类包含18条序列且没有其他植物的氨基酸序列聚在一起，这18条序列之间具有较高的相似性，与其他植物的差异明显。

图3 其他植物与冬青卫矛Ty1-copia-RT氨基酸(aa)序列进化分析Fig.3 Phylogenetic analysis of RT aa sequences of Ty1-copia between other plants and E. japonicus

2.3 Ty3-gypsy类RT序列分析

从冬青卫矛DNA中克隆得到39条Ty3-类RT序列，长度范围为365～499 bp，这些序列中AT所占比例为46.29%～63.47%，核酸序列的相似性为10.04%～99.31%。其中序列EJT3-14与EJT3-17、EJT3-20与 EJT3-30的相似性最高，为99.31%，序列EJT3-3与 EJT3-27的相似性最低，为10.04%。将39条Ty3-类反转录转座子反转录酶DNA序列构建系统进化树，总共可以分为5类(图4)。其中第Ⅰ类有25条序列，第Ⅱ类包含2条序列，第Ⅲ类仅有1条序列为EJT3-38，第IV类含有9条序列，第V类也仅有2条序列为EJT3-11和EJT3-46。

图4 冬青卫矛Ty3-gypsy-RT核酸序列进化树Fig.4 Phylogenetic tree of RT nucleotide sequences of Ty3-gypsy retrotransposons in E. japonicus

将所得39条RT序列翻译为氨基酸。参照Ty3-类RT氨基酸的保守序列，可以发现所得的冬青卫矛Ty3-类RT氨基酸序列有移码突变的情况。例如EJT3-24的8位氨基酸处，EJT3-25的49位氨基酸处，EJT3-6、EJT3-32、EJT3-35等6条的90位氨基酸处，EJT3-40的116位氨基酸处等(图5)。

图5 冬青卫矛Ty3-gypsy-RT氨基酸(aa)序列多重比对分析Fig.5 The amino sequence alignment of RT of Ty3-gypsy retrotransposons in E. japonicus

通过NCBI下载已登录的锯齿列当(ABD43 099，)、梅(ACU42192，)、草莓(EF443064，)、银杏(AJ228325，)、李(AGX45505，)、马尾松(AGD93162，)、火龙果(KU977005，)、桂花(KY401399，)等其他植物Ty3-类RT氨基酸序列，与本文获得相关序列进行多重比对分析，并构建系统进化树，可将所有序列分为4类(图6)。其中第Ⅰ类包含10条冬青卫矛Ty3类RT序列，还包含马尾松AGD93162、锯齿列当ABD43099、桂花KY401399、银杏AJ228325和梅ACU42192等RT氨基酸序列在内；第Ⅱ类仅有1条序列为EJT3-32；第Ⅲ类有9条序列，且无其他植物分入此类，这9条序列相似性高；第Ⅳ类包含17条序列具有较高的相似性，其同源性较高，此类还有其他植物草莓、火龙果。由上述结果可知，冬青卫矛反转录转座子除了物种内的纵向传递外，还可能在不同物种间进行横向传递。

图6 其他植物与冬青卫矛Ty3-gypsy-RT氨基酸(aa)序列进化分析Fig.6 Phylogenetic tree of RT aa sequences of Ty3-gypsy retrotransposons between other plants and E. japonicus

3 结论与讨论

植物体内存在大量且类型多样的反转录转座子。这种可以移动的DNA元件先通过RNA聚合酶合成一条RNA，再经其自身编码的反转录酶反转录为cDNA，在整合酶的作用下插入到基因组其他位置，进而改变了目标物种的基因组结构，对进化发挥了巨大作用。前人研究表明，反转录转座子广泛分布于植物基因组中，且占有极大的比例，其编码区多存在碱基缺失、重复、替换等各种突变，从而导致物种内基因组序列具有较大差异。本研究所获得的冬青卫矛Ty1-与Ty3-类反转录转座子RT序列多重比对结果显示，各类型RT序列相似度普遍偏低，序列平均相似性均为40%左右。其中Ty1-类RT序列EJT1-4与EJT1-7的相似性为8.05%；Ty3-类RT序列EJT3-3与 EJT3-27的相似性为10.04%。产生序列异质性的原因可能是由于转座子序列中碱基本身在插入新位置时的缺失或移码突变，使得冬青卫矛LTR反转录转座子RT碱基顺序存在一定程度的差异。除此以外，LTR反转录转座子能编码反转录酶与整合酶，其转座机制与反转录病毒(遗传信息储存在RNA上)复制和传播机制相似，与DNA复制不同的是RNA可能缺乏核糖核酸复制酶与转录酶的校对修复，使其复制与反转录过程中具有较高的突变率。

本研究获得冬青卫矛Ty1-类和Ty3-类RT序列分别为40条和39条，将其与部分其他物种同种类型反转录酶序列进行了系统进化分析。通过进化树结果可以看出，Ty1-类RT序列分类中的第Ⅰ类里苹果、李、梨、辣椒等植物与冬青卫矛目标序列的遗传距离很近，具有较近的亲缘关系，其中苹果AAX56349与EJT1-17、EJT1-18距离最近，可能同源；Ty3-类RT序列分类中马尾松AGD93162与EJT3-31可能同源，桂花KY401399等与EJT3-9、EJT3-28、EJT3-37等序列具有较近的遗传距离，可能同源。以上结果表明不同类型的LTR反转录转座子都可能在不同的物种间进行横向传递，才导致他们具有同一起源的关系。