香豆素类阴离子荧光探针的研究进展

黄萌萌， 任红宇， 史久州， 陈继超， 池杏微， 卢雯*

香豆素类阴离子荧光探针的研究进展

黄萌萌1， 任红宇1， 史久州1， 陈继超2， 池杏微1， 卢雯1*

（1. 南京林业大学 理学院，江苏 南京 210037；2. 南京林业大学 化学工程学院，江苏 南京 210037）

香豆素是一种重要的天然产物，同时具有优良的生物活性和光学活性。阴离子广泛存在于生命体和自然环境中，对人类的生活有着巨大的影响，因此开发能够特异性检测某种阴离子的荧光探针具有非常重要的科学意义。主要总结了近几年香豆素类阴离子荧光探针的研究进展，重点讨论了检测F-、ClO-、ONOO-以及一些其他阴离子的香豆素类荧光探针的设计合成、响应机制及在环境及生物体中的应用。为进一步设计与构筑新型阴离子荧光探针奠定基础。

香豆素；阴离子；荧光探针；响应机制；生物成像；环境检测

阴离子可以促进人体的血液循环，调节神经系统，在生物体内发挥着重要作用。氟是人体必需的微量元素之一。氟离子可以有效地预防蛀牙、骨质疏松症治疗，然而过量的氟化物会导致牙齿/骨骼氟中毒以及急性胃和肾脏问题，高氟含量与儿童的神经发育障碍有关[1-4]。氰化物被广泛应用在电镀、塑料制造、黄金提取、制革和冶金等行业。但同时氰根离子可以与细胞色素氧化酶活性位点产生强相互作用，使得即使在非常低的浓度下，它对人类健康也是高度致命的[5]。次氯酸盐，在生理条件下部分以次氯酸根离子（ClO-）的形式存在，次氯酸盐的异常产生可导致组织损伤和各种人类疾病，包括关节炎、肝脏缺血再灌注损伤、心血管疾病、类风湿性关节炎、肺损伤、癌症、动脉粥样硬化等[6-7]。过氧亚硝酸阴离子（ONOO-）是由一氧化氮（NO）和超氧化物自由基（O·-）的扩散控制反应所产生的，ONOO-的失衡可能会导致如心血管疾病、神经退行性疾病、阿尔茨海默病、糖尿病、循环休克、炎症性疾病等的产生[8]。因此，研究开发具有高灵敏度和良好选择性的检测阴离子的方法是非常重要的。

传统的检测阴离子的方法主要有质谱、高效液相色谱法、电子顺磁共振光谱法和光学方法等。但是这些方法不适用于检测生物体中的阴离子。荧光探针是一类在紫外―可见―近红外区有特征荧光，并且其荧光性质（激发和发射波长、强度等）可随所处环境的性质改变而灵敏地改变的一类荧光性分子。在过去的十几年中，荧光探针因其高灵敏性、良好的选择性和生物相容性成为重要的生物学研究手段。荧光探针分为化学荧光探针和基因荧光探针，其中化学荧光探针包括有机小分子荧光探针（喹啉衍生物[9]、香豆素衍生物等）和纳米荧光探针[10]。

目前关于香豆素及其衍生物的阴离子荧光探针的综述较少，大都是针对某一阴离子，侧重于从性能方面对其研究现状进行总结分析[11-12]。本综述则是针对常见的阴离子，对其荧光响应性能、与阴离子的响应机制和实际应用几方面进行总结，为香豆素类阴离子荧光探针的设计合成提供一定的思路。

1 香豆素类荧光探针的研究进展

香豆素是一种苯并吡喃类环状结构的天然有机化合物。广泛分布于高等植物的根、花、叶、皮、种子和果实中，因其独特的生物活性（抗氧化活性、抗炎活性等生物活性[13-14]）而受到研究者的广泛关注。尽管香豆素母体的荧光较弱，但是通过对香豆素母体的结构修饰后形成的衍生物却可在可见光范围内表现出较强的荧光发射，同时具有光学活性好、荧光量子产率高、Stokes位移大、溶解性好等优点，使其广泛应用在生物医学和环境科学等领域，包括检测重金属离子、阴离子、有机小分子、活性氧[15]。目前已有很多文献报道了香豆素衍生物在阴离子检测方面的应用。

2 香豆素类阴离子荧光探针的研究进展

2.1 检测F-的荧光探针

F-作为化学元素周期表中电负性最高的阴离子，在生产、生活以及人类健康中扮演着重要角色。研究表明当摄入适当的F-可以很好的预防蛀牙和治疗骨质疏松症。但是作为人体生命活动中的微量元素，当F-的量超过一定限度后会产生牙齿斑纹、会对肾脏和胃功能造成一定的压力，会带来代谢混乱以及一定的神经毒性[16]。因此快速检测F-是非常重要的。

2018年，Ergin等[17]合成了一种以5-羟基吡唑为受体的新型香豆素-吡唑-三嗪基荧光化学传感器1（图1，表1），采用分光光度法和1H-NMR滴定法测定了1对阴离子的选择性。研究结果显示，在CN-和AcO-作为竞争阴离子存在的情况下，它仍然适合于F-的选择性检测。此外，在CH2Cl2中与三氟乙酸相互作用后表现出显著的“发光”效应。

2019年，Li等[18]将二甲基硫代膦基作为识别基团加入香豆素的荧光团中，构筑了一种高灵敏度、高选择性的氟离子荧光探针2（图1，表1）。其识别机制是当氟离子进入体系后触发二甲基硫代膦酰基的裂解，释放香豆素，在455 nm处产生大的荧光增强。探针的荧光增强在0～30 mM范围内与氟离子浓度成正比，检出限为0.29 mM，远低于世界卫生组织（WHO）所建议的适宜安全氟摄入水平。

图1 检测F-探针的结构

2020年，Ji 等[19]基于ICT策略构建了一种新型香豆素比率荧光探针3（图2，表1），该探针对氟离子（F-）的荧光强度增强了30倍，具有良好的灵敏度和高选择性。探针对氟离子的检测机制是利用在F-的作用下Si-O键的裂解，释放出具有强烈绿色荧光信号的荧光基团，从而实现对F-的高效检测。在细胞成像实验中发现，探针3具有良好的细胞膜通透性，可成功定位于线粒体监测活细胞内氟离子，对生物学研究和临床诊断具有重要意义。

2018年，Jiao等[20]成功开发了一种基于荧光素和香豆素荧光基团的新型荧光探针4（图2，表1），用于高选择性、高灵敏度地检测F-。结果表明，加入F-后，探针分子发生了脱硅反应。在0～20 μmol/L范围内，荧光发射强度与F-浓度呈良好的线性关系，最低检出限为0.025 μmol/L。同时，探针4 能够有效地检测活细胞和斑马鱼体内的F-，表现出在临床诊断中的应用潜力。

图2 F-荧光探针的结构及检测机理

2.2 检测ClO-的荧光探针

次氯酸是一种弱酸，在生理条件下多以次氯酸根离子的形式存在，是一种重要的活性氧[21]。在机体中过氧化物酶的催化作用下，由氯离子和过氧化氢发生过氧化物反应而产生的。在免疫系统中HOCl表现出强氧化性，而次氯酸盐的异常会产生导致组织损伤和各种疾病，包括关节炎、心血管疾病、类风湿以及动脉硬化等。因此实现对ClO-的检测是十分必要的。

2018年，Wang等[22]研制了一种香豆素席夫碱化合物5（图3，表1），并成功地用于高选择性的ClO-的荧光检测。在该探针中加入ClO-后，溶液颜色黄绿色变成无色，荧光发射由绿光转变为蓝色荧光，从而实现了ClO-的裸眼识别。该荧光探针的识别机制是先发生亲核加成反应，再进一步水解来实现的。同时，该探针分子具有低细胞毒性和良好的细胞通透性，使其可以通过单光子和双光子显微镜成像在活细胞和斑马鱼中检测ClO-。因此该化合物是一种具有分析生物样品中ClO-潜力的灵敏性荧光探针。

2019年，He 等[23]以香豆素为给体，罗丹明为受体合成一种基于荧光共振能量转移的分子探针6（图3，表1），实现了溶酶体中HOCl的比率成像。该探针对HOCl具有较高的敏感性、较快的反应速度以及较好的选择性。同时，它被成功地用于低细胞毒性内源性HOCl的成像。

2020年，Nie等[24]设计合成了一种新型香豆素近红外荧光化合物7（图3，表1）。该化合物在713 nm处有较强的近红外发射和较好的信号分辨率。比率发射（496 nm/713 nm）可以保证次氯酸（HOCl）在体内和体外的准确检测。荧光选择性和灵敏度以及荧光成像结果表明化合物7可以作为HeLa细胞中外源性和内源性HOCl检测的可视化比率荧光探针。

图3 ClO-荧光探针的结构

2.3 检测ONOO-的荧光探针

ONOO-是生物体内一种重要的活性氧，在生物系统中ONOO-是由NO和超氧自由基的扩散控制反应产生的，具有较强的氧化性和活性，可以与多种活性物质发生反应从而导致细胞的死亡。在研究中发现，ONOO-可以通过协调免疫系统来对抗病原体，但是ONOO-的不平衡会导致如糖尿病、癌症以及炎症等多种疾病的产生。因此，开发出快速有效监测活体中ONOO-的荧光探针具有重要的意义。

2020年，陈宇等[25]利用苯并吡喃腈―香豆素体系, 合成了一种用于ONOO-检测的近红外比率型荧光探针8（图4，表1）。该探针在ONOO-存在下表现出强烈的响应，溶液的颜色由紫色变为浅粉色，荧光发射从淡紫色光变为蓝光，能够直观地对溶液中的ONOO-进行监测，具有较低的检出限，同时可以有效地在HeLa细胞对ONOO-进行检测。

2019年，Shen等[26]以香豆素为荧光团，二苯基膦酸盐为识别基团，构建了一种检测ONOO-的荧光探针（图4，表1）。该探针的响应机制是ONOO-能够去除探针分子上的二苯基膦酸盐基团从而实现对ONOO-的检测。探针9可以在3分钟内实现对ONOO-的快速检测，同时具有优异的选择性和灵敏度，并且发生明显的颜色变化（红色到绿色）以及大的发射波长偏移特点而被应用于活细胞中的ONOO-的检测。

图4 ONOO-探针的结构

2.4 检测其他阴离子的荧光探针

2019，Meng等[27]合成了一种高选择性荧光化学传感器10（图5，表1）。在CH3CN/HEPES缓冲介质（9∶1，/）中，化合物10可以对Cu2+和H2PO4-进行连续检测。化合物10对Cu2+的检出限为0.37 μM，探针-Cu2+配合物对H2PO4-的检出限为1.6 μM。使用Cu2+和H2PO4-可以重复4次识别行为，且荧光效率损失很小。对Cu2+和H2PO4-检测的稳定pH范围为4～7.5。

2018年，Chemchem等[28]设计并合成了一种用于检测水溶液中氰根离子的比色荧光化学传感器（探针11，图5，表1）。当CN-加入该探针的DMSO/水（6∶4，/）的混合溶液中时，则荧光发射显示出较强的绿色荧光，溶液的颜色由黄色变成红色。这种荧光探针可用于检测浓度低至0.32 µM的CN-，低于世界卫生组织规定的饮用水中的氰化物最大含量（1.9 µM）。此外，通过对11与DNA相互作用的紫外光谱和荧光光谱研究表明，小牛胸腺DNA与探针11之间存在插入性结合。

2019年，Wu M X等[29]设计了一种以四羟蒽和香豆素为单位的检测亚硫酸氢根离子的探针（探针12，图5，表1）。在乙腈-磷酸缓冲盐水（1∶9，/）溶液中，探针具有较高的选择性，从蓝色到黄色的颜色变化明显，对亚硫酸氢根离子有较大的启动信号和绿色发射。同时，荧光强度在514 nm处与亚硫酸氢根离子的浓度呈良好的线性关系。探针对亚硫酸氢根离子的响应时间在数秒以内，检测限为22.8 nM。荧光共定位研究表明，探针是一种线粒体靶向荧光探针，可用于活的HeLa细胞中亚硫酸氢根离子生物成像。

图5 探针的结构

表1 文中所列离子的检出限、响应机制及应用

3 总结与展望

本文从检出限、响应机制和实际应用三个方面总结了近几年来基于香豆素及其衍生物的荧光探针在阴离子检测领域的研究进展。阴离子荧光探针在生化、医学和环境检测等领域具有重要作用，是当前超分子化学的研究热点之一。目前，研究者们已在开发阴离子探针荧光探针方面开展了大量的工作，取得了重大研究进展。但是，由于阴离子比等电子的阳离子大从而导致它们的静电键合作用小，阴离子对pH较敏感使得阴离子荧光探针的设计具有较高的挑战性。F-、ClO-、ONOO-以及一些在生命活动中具有重要作用的其他阴离子，这些离子的存在或多或少会对生命活动产生一定的影响，仍然需要开发更稳定、灵敏性更强的对阴离子进行检测的荧光探针，更加明确地了解病理过程，为疾病的精确诊断提供理论基础，快速有效地寻找这些阴离子造成的一些疾病地解决方案，从而更好的为人类健康提供服务。

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Progress of Coumarin Fluorescent Sensor for Detecting Anion

HUANG Meng-meng1, REN Hong-yu1, SHI Jiu-zhou1,CHEN Ji-chao2, CHI Xing-wei1, LU Wen1*

（1. College of Science, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, China;2. College of Chemical Engineering, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, China）

Coumarin is an important natural product with excellent biological and optical activity. Anions are widely existing in living organisms and environment, which have a great impact on human life. Therefore, it is of great scientific significance to develop fluorescent probes that can specifically detect certain anions. This paper mainly summarizes the research progress of coumarin-based anion fluorescent probes in recent years, focusing on the design, synthesis, response mechanism and application in environment and organisms of coumarin-based fluorescent probes for detecting F-, ClO-, ONOO-and some other anions. It lays a foundation for the further design and construction of new anion fluorescent probes.

coumarin; anion; fluorescent probe;response mechanism; biological imaging; environmental detection

2021-08-26

南京林业大学青年科技创新基金项目（CX2017017）；南京林业大学大学生创新训练计划项目（2020NFUSPITP0223）。

黄萌萌（2001～），女，贵州铜仁人，本科；高分子材料与工程专业。1518897756@qq.com

卢雯（1982～），女，安徽蒙城人，博士，讲师；主要从事配位化学研究。luwen@njfu.edu.cn

O625

A

1009-220X(2022)01-0001-07

10.16560/j.cnki.gzhx.20220114