基于网络药理学探讨淫羊藿治疗强直性脊柱炎的作用机制※

石金杰 刘宏潇

(1.北京中医药大学2019级硕士研究生,北京 100029；2.中国中医科学院广安门医院风湿病科，北京 100053)

强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)多发生于青壮年男性群体，是以中轴关节附着点炎症为主要表现的慢性免疫性炎性疾病，严重者可引起脊柱强直和纤维化，造成不同程度多系统病变。我国AS患病率约为0.3%，具有遗传性，有较高的致残率，严重影响患者生活质量，晚期发生脊柱强直、关节畸形后病情不可逆转，因此减少致残率的关键在于早诊断、早治疗[1-3]。现代生物制剂虽可有效抑制炎症，但价格高，不易储存，且在新骨形成方面的作用不甚理想。大量研究表明，中医药治疗AS有一定的特色和优势，可从整体出发，辨证论治，因其个体化方案、多靶点、副作用少、价格居中的特点，逐渐成为当今研究治疗AS新型药物的重要方向。

淫羊藿始载于《神农本草经》，为小檗科植物，性温，味辛、甘，入肾、肝经，有温肾壮阳、强筋健骨、祛风除湿作用[4]。现代药理学研究表明，淫羊藿具有免疫调节、抗肿瘤、抗氧化等多种药理活性[5]，作为补肾类代表性药物，临床治疗AS疗效明确。因此，本研究从网络药理学角度出发，探讨淫羊藿治疗AS的作用机制。

1 材料与方法

1.1 淫羊藿活性成分和作用靶点的查询与筛选 运用中药系统药理学数据库与分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)，搜索关键词“淫羊藿”，设定口服利用度(oral bioavailability，OB)≥30%和类药性(drug-likeness，DL)≥0.18，进一步筛选其活性成分及对应的潜在作用靶点。为标准化靶点信息，利用Perl软件和Uniprot(https://www.uniprot.org)数据库，将活性成分作用的靶点进行规范，获取淫羊藿靶点。

1.2 AS疾病靶点筛选 以“Ankylosing Spondylitis”为检索词分别在GeneCards(https://www.genecards.org/)、OMIM(https://www.omim.org/)数据库进行疾病基因靶点的查询筛选，获取AS目前确定的疾病靶点。

1.3 淫羊藿-AS交集靶点获取及药物-活性成分-靶点-疾病网络构建 利用韦恩在线绘制网站(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)获得淫羊藿靶点与AS疾病靶点的交集靶点。将淫羊藿活性成分及淫羊藿与AS的交集靶点导入Cytoscape 3.7.1软件，进行药物-活性成分-靶点-疾病网络构建及可视化，并进行拓扑分析，再次筛选淫羊藿治疗AS的主要活性成分。

1.4 蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络构建 将交集靶点输入STRING 11.0数据库(https://string-db.org)构建 PPI网络模型，生物种类设定为“Homo sapiens”，设置medium confidence参数为0.9，去除边缘游离蛋白，其余设置均为默认设置。利用Cytoscape 3.7.1软件的分析插件MCODE对PPI网络图的拓扑属性分析和功能模块进行分析，得到淫羊藿治疗AS的核心靶点。

1.5 基因本体(GO)功能富集分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析 利用Metascape(https://metascape.org)平台，将获得的交集靶点输入该平台，以P<0.05为筛选条件，得到GO、KEGG富集分析结果，最终借助微生信平台(https://www.bioinformatics.com.cn/)可视化。

2 结果

2.1 淫羊藿活性成分及作用靶点的获取 经药代动力学[吸收(Absorption)、分布(Distribution)、代谢(Metabolism)、排泄(Excretion)，ADME]分析后，获取淫羊藿活性成分23种(见表1)，淫羊藿作用靶点201个。

2.2 AS疾病靶点的获取 合并GeneCards、OMIM数据库得到的疾病靶点，并删除重复靶点，最终得到2771个AS疾病靶点。

2.3 淫羊藿-AS交集靶点获取及药物-活性成分-靶点-疾病网络图 将筛选的淫羊藿与AS交集靶点绘制韦恩图，最终得到68个交集靶点(见图1)。运用Cytoscape 3.7.1软件获得药物-活性成分-靶点-疾病网络图及可视化(见图2)，深蓝色椭圆形表示中药淫羊藿，蓝色菱形表示AS，黄色方形表示淫羊藿的活性成分，绿色椭圆形表示AS与淫羊藿的交集靶点。运用Cytoscape 3.7.1软件中Network Analyzer工具对其进行拓扑分析，得到连接度(Degree)、紧密度 (closeness centrality, CC) 及介度 (betweeness centrality,BC)结果。靶点之间边的数量为靶点的Degree值，筛选Degree值前5的活性成分为淫羊藿治疗AS的核心活性成分(见表2)。

表1 淫羊藿活性成分

图1 淫羊藿-AS交集靶点韦恩图

图2 药物-活性成分-靶点-疾病网络图

表2 淫羊藿治疗AS的核心活性成分

2.4 PPI网络构建及分析 将68个交集靶点输入到STRING 11.0平台，得到PPI网络(见图3)。运用Cytoscape 3.7.1软件对其进行拓扑分析Degree值，以Degree值为标准，图中节点颜色越深、大小越大表示该靶点的Degree值越高，与其他靶点相关性越大,筛选Degree值前10的靶点为淫羊藿治疗AS的核心靶点，即白细胞介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子(TNF)、CXC趋化因子配体8(CXCL8)、IL-1β、血管内皮生长因子A(VEGFA)、丝裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)、CC趋化因子配体2(CCL2)、IL-10、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、表皮生长因子受体(EGFR)为PPI网络图中的核心靶点。

图3 PPI网络图

2.5 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析 将上述68个交集靶点导入Metascape数据库进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，将所得结果可视化。获得1070条GO功能条目(P<0.05)，包括1291个生物过程(BP)、56个细胞组分(CC)、82个分子功能(MF)；KEGG通路富集分析获得240条通路。以P值为标准，-LogP值越大表明富集程度越大，筛选每部分显著性前10的条目绘制GO功能富集分析条形图(见图4)和显著性前20的通路绘制KEGG通路富集分析条形图(见图5)。

由上述结果可知，BP与对脂多糖的反应(response to lipopolysaccharide)、对细菌起源的分子的反应(response to molecule of bacterial origin)、对细菌的反应(response to bacterium)、炎性反应调节(regulation of inflammatory response)、防御反应调节(regulation of defense response)等相关，CC与囊泡腔(vesicle lumen)、薄膜筏(membrane raft)、膜微区(membrane microdomain)、分泌颗粒腔(secretory granule lumen)、胞质囊腔(cytoplasmic vesicle lumen)等相关，MF与细胞因子活性(cytokine activity)、细胞因子受体结合(cytokine receptor binding)、受体配体活性(receptor ligand activity)、信号受体激活剂活性(signaling receptor activator activity)、信号受体调节剂活性(signaling receptor regulator activity)等相关，推测淫羊藿的活性成分主要通过调节以上功能来治疗AS。

KEGG通路富集分析结果主要富集在IL-17信号通路(IL-17 signaling pathway)、晚期糖基化终末产物-晚期糖基化终末产物受体(AGE-RAGE)信号通路、TNF信号通路(TNF signaling pathway)、流体剪切应力和动脉粥样硬化(Fluid shear stress and atherosclerosis)、利什曼病(Leishmania infection)、细胞因子-细胞因子受体相互作用(Cytokine-cytokine receptor interaction)。此外与AS相关的通路还有辅助性T 淋巴细胞17(Th17)细胞分化信号通路、核转录因子-κB(NF-κB)信号通路、T细胞受体信号通路等通路。

图4 GO功能富集分析条形图

图5 KEGG通路富集分析条形图

3 讨论

中医学认为，AS属肾痹、骨痹、大偻范畴。肾主骨生髓，若先天禀赋不足，肾气虚衰，风、寒、湿等外邪深侵肾督，督脉失养，阻滞经络、脊柱、关节等处，则发而为痹[6]，临床可表现为关节屈伸不利、腰背疼痛、行动不便等症状。肾为先天之本，补肾类药物可调节人体免疫，平衡免疫网络。AS根本病机以肾虚为本，补肾强督法为基本治则贯穿始终。淫羊藿温肾壮阳，强筋骨，祛风湿，是治疗AS补肾方中的代表药物。

炎症损伤和新骨形成是AS发病甚至致残的重要机制，因此控制炎症、延缓新骨形成具有重要的临床意义，也是治疗AS的首要目标。现代药理学研究发现，淫羊藿可通过调节Th17的分化及IL-17的表达水平,达到控制AS炎症的作用[7]。本研究发现，淫羊藿主要通过槲皮素、木犀草素、山奈酚、8-(3-甲基丁-2-烯基)-2-苯基色酮、脱水淫羊藿素、“C-Homoerythrinan,1,6-didehydro-3,15,16-trimethoxy-,(3-beta.)-”、淫羊藿苷等核心活性成分作用于IL-6、TNF、趋化因子CXCL8、IL-1β、VEGFA、MAPK1、CCL2、IL-10、ICAM-1、EGFR等核心靶点，从而达到发挥抑制炎症、抗纤维化、保护软骨的作用[8]。细胞因子在免疫反应中交织成网络并影响和调节细胞间的免疫应答，大量研究表明，细胞因子网络异常是AS病理机制的关键，在AS病理进展过程中发挥重要作用[9]。TNF及处于其下游的IL-6是各类脊柱关节病的主要炎症介质，VEGF、IL-10、IL-1等细胞因子与AS疾病活动均相关。研究发现，槲皮素、木犀草素、山奈酚可通过抑制IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的表达水平发挥抗炎作用[10-11]。木犀草素能降低由 TNF介导的IL-6、IL-8 、VEGF的表达，也可能通过NF-κB信号通路从而抑制免疫而产生抗炎作用[12]。吴汉军等[13]研究发现，木犀草素抑制小鼠T淋巴细胞增殖和活化的作用机制可能与抑制IL-2 mRNA、干扰素γ(INF-γ)mRNA的表达有关。淫羊藿苷在控制炎症和延缓新骨形成方面发挥着重要作用，首先在控制炎症方面，淫羊藿苷可以影响T淋巴细胞的功能,抑制Th1/Th17轴应答而控制炎症发展；在延缓新骨形成方面，淫羊藿苷可以通过调控细胞因子骨形态发生蛋白-2(BMP-2)、转化生长因子β1(TGF-β1)而影响成纤维细胞向成骨型的分化[14]。

GO功能富集展示了淫羊藿治疗AS的靶蛋白在细胞内的存在位点、潜在分子及生物学过程。KEGG通路富集分析显示，淫羊藿治疗AS的生物学通路主要作用于IL-17信号通路、AGE-RAGE信号通路、TNF信号通路、NF-κB信号通路、Th17细胞分化信号通路等。Th17/IL-17炎症轴在AS炎症中发挥了十分重要的作用[15-16]。炎症细胞因子IL-17通过IL-6积累中性粒细胞，促使急性炎症的发生，且有研究证实男性AS患者IL-17水平比女性患者高表达[17]。AGE-RAGE 的相互作用也在IL-17免疫反应中发挥作用，AGE 通过介导 RAGE 表达上调，使IL-17A的分泌增加，从而促进炎症的发生[18]。TNF-α在AS患者的外周血中高表达，可造成患者关节局部一系列炎症反应，而IL-17A已被证明能增强TNF介导的关节炎症和组织破坏能力，加强破骨细胞的活性和溶骨作用，从而损害关节[19]。多项研究证实，AS患者的血液呈高凝状态，主要机制与TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17等细胞因子紊乱和NF-κB信号通路之间的相互作用相关[20]。

本研究从淫羊藿的物质基础出发，从生物信息学角度预测分析其核心活性成分槲皮素、木犀草素、山奈酚、淫羊藿苷等潜在活性成分可通过调控IL-17信号通路、TNF信号通路、NF-κB信号通路等多靶点、多途径影响AS疾病进展，可为中药新药的研发和临床治疗AS提供研究基础和创新思路。