壳寡糖对PM2.5 染毒后小鼠肺和骨髓中Wnt/β-catenin 信号通路表达的影响

严伟健，张惠琴，刘丽丽，叶中绿，黄 明，田 川

（广东医科大学附属医院儿童医学中心,广东湛江 524001）

近些年大气污染日益严重，以粒径低于2.5 μm的细颗粒物(PM2.5)对人体的损害最为严重[1]。PM2.5 能够直接或间接作用于机体内的炎症细胞，激活各种炎症细胞，引起局部组织或系统炎症[2]，是损害人体健康的关键机制。而壳寡糖及其衍生物已被证明具有抗炎、免疫刺激、抗肿瘤、促进组织再生、抗菌、抗氧化等多种生物学活性[3-8]。本实验通过比较壳寡糖干预前后炎症模型小鼠Wnt/β-catenin 信号通路相关蛋白的表达，旨在探讨壳寡糖是否通过抑制Wnt/β-catenin 信号通路改善炎症反应。

1 材料和方法

1.1 动物和分组

6～8 周龄SPF 级C57BL/6J 小鼠，共32 只，雄性，身体质量为16.1～19.4 g，均由南京大学生物医学研究院提供，动物许可证号：SCXK(苏)2015-0001。按照随机数字表法分为空白对照组、模型组（阳性对照组）、壳寡糖组、阴性对照组，每组8只。

1.2 主要试剂与仪器

壳寡糖（分子量＜1 500，纯度＞90%，青岛博智汇力生物科技有限公司），BCA 蛋白浓度测定试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司），Cyclin D1 Rabbit mAb、β-Catenin Rabbit mAb、C-myc Rabbit mAb 均购自Cell Signaling Technology 公司，Western 电泳仪（上海天能公司），OLYMPUS DP71 显微照相系统（日本OLYMPUS 公司）

1.3 方法

1.3.1 PM2.5 的采集和配备 选择广东省湛江市霞山区人民大道南路段作为PM2.5 采集点，使用QJS-100D 型多级颗粒物采集器采集，将采有细颗粒物的滤纸剪成约1 cm×1 cm 小块浸于蒸馏水中，4 ℃超声振荡30 min，重复5 次，洗脱颗粒物，振荡液经8 层纱布过滤，真空冷冻干燥机冷冻干燥，收集干粉，并用生理盐水配制成200 mg/L的PM2.5悬液，4 ℃保存。

1.3.2 PM2.5 所致炎症反应模型的建立模型组、壳寡糖组小鼠每3 d 染毒1 次，共染毒10 次；余2 组以等量生理盐水气管滴注。具体操作为用1 mL 注射器连接4.5 号头皮针，先抽取0.1 mL 气体，再按实验分组，分别取预先抽好的生理盐水、200 mg/L的PM2.5悬液各50 μL。待小鼠充分麻醉后进行气管穿刺，模型组及壳寡糖组将PM2.5 悬液从头皮针中注入气管，余2 组注入等量生理盐水。PM2.5 染毒结束后，壳寡糖组、阴性对照组予小鼠予壳寡糖（600 mg/kg）灌胃，余2组以等量双蒸水灌胃，每天1次，连续2周。

1.3.3 样本采集 （1）肺组织的收集及固定：每组取两只小鼠左肺放入10%固定中性色福尔马林固定液中充分固定；余下6 只则放入洁净1.5 mL EP 管中，于−80 ℃冰箱中保存。（2）骨髓组织的收集及处理：每组取2 只小鼠股骨，去除骨表面附着的肌肉及软组织，于10%福尔马林溶液中固定。每组余下6 只则取双侧股骨及胫骨置于装有PBS 缓冲液的无菌EP 管中，用镊子钳起骨头的一端，并用注射器吸取PBS 缓冲液冲洗骨髓腔，由一端骨髓腔冲出骨髓组织，再反方向冲出骨髓，直到股骨中呈透明状态停止。收集骨髓细胞悬液于1.5 mL 离心管中，保存于−80 ℃冰箱中。

1.3.4 小鼠组织蛋白提取 称取各实验组小鼠的肺组织600 mg 并剪碎。骨髓细胞悬液计算其细胞数后，1 200 r/min 离心5 min，弃上清取沉淀即为骨髓细胞。肺组织以每10 mg加100 μL裂解液，而骨髓组织则按细胞数每1×106/L 加200 μL 充分裂解。裂解后于4 ℃、12 000 r/min 离心15 min 后，弃沉淀，取上清液于洁净1.5 mL EP 管中，−80 ℃保存。按碧云天BCA 浓度测定试剂盒说明书将提取的蛋白样品进行浓度测定。

1.3.5 蛋白质免疫印迹实验（Western blotting）将蛋白样品解冻后，从各组蛋白中取出相同蛋白量，配平至一致浓度，然后按4∶1 加入SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液(5X)，吹打混匀。放入沸水中，煮5 min，使蛋白变性。配制10%分离胶、5%浓缩胶。上样后先用80 V的恒压电压，待溴酚蓝跑至浓缩胶时，即转为恒压120 V，约50 min后电泳结束。取出待转膜样品凝胶，组装成“三明治”夹层，设定转膜恒定电流250 mA，转膜时间为90 min。转膜结束后将膜夹出放于TBS-T中，摇床上摇洗两次，每次5 min。将膜放入培养皿中，加入5%封闭液，摇床上慢摇封闭1 h。将条带加入对应一抗中，于4 ℃冰箱中孵育过夜。次日，将孵育盒置于摇床上室温慢摇复温1 h；回收一抗，将膜放入TBS-T 中，用摇床摇洗5 次，每次5 min；将目的条带和内参条带分别放入胶盒中，加入适量二抗封闭液，将孵育盒置于摇床上室温慢摇1 h 左右。孵完二抗后，回收二抗，将膜夹出，放TBS-T 中，用摇床快摇5 次，每次5 min。在Tanon5200 成像系统中曝光条带，ImageJ分析各目的蛋白条带灰度值。

1.3.6 小鼠肺组织石蜡切片制备及HE染色 取各组小鼠的左侧肺置于10%中性福尔马林中固定48 h 以上，再进行乙醇梯度脱水、透明、石蜡包埋、脱蜡、梯度酒精复水，后进行染色,在光学显微镜下观察肺组织病理形态。

1.3.7 小鼠骨髓组织石蜡切片制备及HE染色 每组随机选取2 只小鼠左侧股骨，用无菌纱布擦去股骨周围的软组织，放入10 %中性福尔马林中固定24 h 以上。进行脱钙、梯度脱水、透明、浸蜡、包埋、修块及切片、脱蜡、水洗，后进行染色，光镜下观察各组小鼠骨髓组织病理形态。

1.4 统计学处理

实验数据采用SPSS 23.0 进行统计分析，用GraphPad Prism5统计软件作图。计量数据以xˉ±s表示，采用单因素方差分析，方差齐则采用LSD-t检验法进行多重比较，不齐则用Dunnett’T3 检验。以α=0.05 为检验水准，P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各处理实验组小鼠肺组织病理切片、HE染色

空白对照组小鼠肺组织结构清晰，无明显病理改变。模型组小鼠肺组织结构破坏严重，炎症细胞弥漫浸润，肺泡壁明显增厚，但予壳寡糖灌胃后，病变改善明显。骨髓组织病理切片显示空白对照组小鼠骨髓组织切片各细胞形态正常，可见少量的巨核细胞散在分布；模型组小鼠骨髓组织中的巨核细胞数量明显增多；壳寡糖组巨核细胞较模型组少，稍多于对照组。见图1、2。

图1 各组肺组织病理切片（HE染色，×100）

2.2 各组小鼠肺组织及骨髓组织的β-catenin、c-myc、Cyclin-D1 蛋白的表达水平

通过Western-blot 检测各组小鼠肺组织的βcatenin、c-myc、Cyclin-D1 蛋白水平，结果显示：在内参β-actin 整齐的情况下，与空白对照组相比，模型组肺和骨髓组织中β-catenin、c-myc、CyclinD1 蛋白表达量明显升高，差异有统计学意义（P＜0.01）。而壳寡糖组β-catenin、c-myc、Cyclin-D1 蛋白表达量明显比模型组减少，差异有统计学意义（P＜0.01）。在肺组织及骨髓组织中，空白对照组与阴性对照组相比差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表1、2，图3、4。

图3 各组肺组织β-catenin、c-myc、Cyclin-D1蛋白表达水平

表1 各组小鼠肺组织β-catenin、c-myc、Cyclin-D1 蛋白表达水平 (±s)

表1 各组小鼠肺组织β-catenin、c-myc、Cyclin-D1 蛋白表达水平 (±s)

与空白对照组比较：aP＜0.01；与模型组比较：bP＜0.01

3 讨论

PM2.5 易富集空气中的有机污染物、有毒重金属、酸性氧化物、病原体等，且能较长时间停留在空气中，通过呼吸道进入人体，并在肺泡内持续产生损伤，对呼吸系统影响极为严重。本研究通过气管滴注PM2.5 的方法染毒C57 小鼠建立亚急性炎症模型，该方法是目前PM2.5 染毒方法中应用最广泛及且经济的方法。目前PM2.5 对各系统的损害作用主要通过诱发多个脏器发生炎症反应及氧化应激损害所致。本课题组在前期研究已发现PM2.5 能引起骨髓组织ROS 产生增多、SOD 酶活性减低，PM2.5 染毒后炎症细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α的分泌水平升高。

图2 各组骨髓组织病理切片（HE染色，×100）

表2 各组小鼠骨髓组织β-catenin、c-myc、Cyclin-D1蛋白表达水平 (±s)

表2 各组小鼠骨髓组织β-catenin、c-myc、Cyclin-D1蛋白表达水平 (±s)

与空白对照组比较：aP＜0.01；与模型组比较：bP＜0.01

图4 各组骨髓组织β-catenin、c-myc、Cyclin-D1蛋白表达水平

壳寡糖是目前已知唯一的碱性寡糖，对机体无毒性不良反应，有较好的生物相容性和可降解性，具有抗炎、免疫调节、抑制肿瘤生长等作用[3,5]。气管内滴注PM2.5混悬液可诱导小鼠炎症模型。本研究发现，气管滴注PM2.5 悬液后模型组小鼠肺间质充满了炎症细胞，肺组织水肿严重，肺泡间隔增厚，而骨髓组织巨核细胞较空白对照组明显升高，而壳寡糖给药后可逆转这一损伤性变化，可见壳寡糖对PM2.5引起的肺和骨髓组织炎症反应有改善作用。

本课题组前期研究已证实长期的PM2.5 暴露会引起骨髓的炎症反应。炎症是机体的防御反应，适度的炎症反应对机体各器官及系统起保护作用,但近年来有大量研究指出炎症反应与肿瘤的发生及发展有密切联系，其两者是相互调节的事件。通过产生局部炎症反应，免疫细胞可释放多种细胞因子和生长因子建立和维持肿瘤微环境[9]。慢性、持续的炎症反应导致了多种肿瘤的恶变和扩散。Wnt/β-cantnin 为经典炎症信号通路，其靶蛋白β-cantnin、c-myc、CyclinD1在多发性骨髓瘤、白血病、淋巴瘤等血液系统恶性疾病中表达并与预后相关。本实验用PM2.5 亚急性染毒C57 小鼠后，模型组小鼠肺组织和骨髓组织中βcantnin、c-myc、CyclinD1 蛋白表达均较对照组显著上升，提示PM2.5 长期暴露后会引起机体Wnt/β-cantnin信号通路的活化，与文献报道一致[10]。而予壳寡糖干预后上述指标表达均有所下降，但仍高于空白对照组及阴性对照组，肺组织与骨髓组织均呈现同样的趋势，类似的差异在病理切片中及前期对于炎症细胞因子表达的研究中也观察到，提示壳寡糖可能抑制该信号通路的活化，并通过抑制wnt/β-cantnin 的活化来改善由PM2.5所致的肺损害和骨髓毒性。

Wnt信号在炎症及肿瘤发生、发展中处于中心位置观点。各种致病因素不仅可以直接作用于Wnt/βcatenin 信号通路引发相关的疾病，还能通过其他通路活化Wnt/β-catenin 信号通路，间接的依靠Wnt/βcatenin 信号通路产生一系列病理生理改变。如急性髓系白血病细胞通过自分泌wnt3a激活Wnt/β-catenin信号通路导致疾病的发生，故Wnt/β-catenin 信号通路抑制剂有可能成为新一代抗肿瘤的靶向药物。

综上所述，壳寡糖可改善由PM2.5诱发的炎症反应，其机制可能与抑制Wnt/β-cantnin信息通路表达有关，本研究初步揭示了壳寡糖改善PM2.5诱发的炎症反应的分子机制，为壳寡糖进一步临床的开发应用提供了实验支持。