UPLC-QQQ-MS/MS同时测定金银花饮片中核苷类成分的含量

任天航，周正园，聂紫璇，王君月，廉婧，刘蓬蓬，史辑

(辽宁中医药大学药学院，国家中医药管理局中药炮制原理解析重点实验室，辽宁省中药炮制工程技术研究中心，辽宁 大连 116600)

金银花为忍冬科植物忍冬(LonicerajaponicaThunb.)的干燥花蕾或带初开的花，夏初花开放前采收，干燥，具有清热解毒、疏散风热之功效，可用于痈肿疔疮、热毒血痢、风热感冒等症的治疗[1]。金银花主要分布于我国山东、河南等地，药理学研究发现，金银花具有抗炎、抗病毒、抗氧化、保肝等药效作用，其主要含有的化学成分包括黄酮类、皂苷类、环烯醚萜类、挥发油等[2-3]。而有关金银花中核苷类成分的研究近年来报道较少，核苷类成分是维持生命活动的重要活性物质，经药效学研究发现，具有抗病毒、抗肿瘤、抗血小板聚集等多种功效[4-6]。王芳等[7]首次从金银花中分离鸟苷、5-甲氧基尿嘧啶等核苷类成分，此后有关金银花核苷类成分报道较少，故本研究将采用超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱(UPLC-QQQ-MS/MS)技术，建立同时测定金银花饮片水提液中核苷类成分含量的方法，并比较研究不同道地产地金银花饮片水提液中核苷类成分含量的差异，为金银花饮片的生产加工和提高质量评价标准提供参考依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 ACQUITY H-CLASS型UPLC仪(包括二极管阵列检测器、二元高压泵、在线脱气装置、自动进样器、柱温箱，数据采集与处理采用MassLnx 软件)和XEVO TQD型MS仪均购自美国Waters公司；Mettler AE240型十万分之一分析天平(瑞士Mettler公司)；DHF-200型手提式高速万能打粉机(温岭市林大机械有限公司)；FA1004B型电子天平(上海精密科学仪器有限公司)；KQ-250DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；Milli-Q纯水仪(美国Millipore公司)。

1.2 试药 金银花饮片5批购自河南、河北、山东、安徽等地；对照品尿嘧啶、鸟嘌呤、黄嘌呤、β-胸苷、尿苷、2′-脱氧腺苷、2′-脱氧鸟苷、肌苷、鸟苷(成都德思特生物技术有限公司，批号：DSTDN009201、DST201009-046、DST201025-195、DST201103-093、DSTDN003401、DST200922-143、DSTDJ010901、DST201029-029、DST201029-029，纯度均不低于98%)；乙腈、甲酸为质谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 分析条件[8-9]

2.1.1 色谱条件 Waters BEH C18(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)色谱柱；流动相：乙腈(A)- 0.1%甲酸水(B)，梯度洗脱(0～3 min，20%B → 25%B；3～5 min，25%B → 45%B；5～6 min，45%B → 60%B；6～6.5 min，60%B → 20%B；6.5～10 min，20%B)；流速：0.4 mL·min-1；柱温：30 ℃ ；进样量：3 μL。

2.1.2 质谱条件 采用电喷雾离子源(ESI)，正离子多反应检测(MRM)模式。毛细管电压：3.0 kV；离子源温度150 ℃；脱溶剂气N2，脱溶剂气流量1 000 L·h-1；脱溶剂温度：500 ℃。9种核苷成在MRM 模式下的色谱保留时间和具体质谱参数见表1，全扫描质谱图见图1～9，MRM离子色谱图见图10～18。

表1 优化的质谱条件参数

图1 尿嘧啶质谱图

图2 鸟嘌呤质谱图

图3 黄嘌呤质谱图

图4 β-胸苷质谱图

图5 尿苷质谱图

图6 2′-脱氧腺苷质谱图

图7 2′-脱氧鸟苷质谱图

图8 肌苷质谱图

图9 鸟苷质谱图

图10 尿嘧啶MRM离子色谱图

图11 鸟嘌呤MRM离子色谱图

图12 黄嘌呤MRM离子色谱图

图13 β-胸苷MRM离子色谱图

图14 尿苷MRM离子色谱图

图15 2′-脱氧腺苷MRM离子色谱图

图16 2′-脱氧鸟苷MRM离子色谱图

图17 肌苷MRM离子色谱图

图18 鸟苷MRM离子色谱图

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取尿嘧啶、鸟嘌呤、黄嘌呤、β-胸苷、尿苷、2′-脱氧腺苷、2′-脱氧鸟苷、肌苷、鸟苷的对照品适量，分别置于10 mL量瓶中，鸟嘌呤加入0.1mol·L-1盐酸溶液，黄嘌呤加入0.1%氢氧化钾溶液，其他对照品加入超纯水溶解，室温定容，均配制成单一对照品溶液，4 ℃冰箱储存备用。

2.2.2 样品溶液的制备 取样品0.5 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入超纯水20 mL，称量，密封冷藏过夜，超声提取(250 W，40 kHz)60 min，放冷至室温，用超纯水补足减失的量，离心，取上清液用0.22 μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液，置于冰箱4 ℃储存备用[10-11]。

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系考察 精密吸取“2.2.1”项下对照品储备液适量，逐级稀释得到5个不同浓度的系列对照品溶液，在“2.1.1”和“2.1.2”项下条件进样分析，以对照品的质量浓度X(μg·mL-1)为横坐标，以相应的峰面积Y为纵坐标，进行线性回归，回归方程、相关系数和线性范围见表2；分别以各成分标准品的信噪比(S/N)等于3和10时所对应的浓度定为检测限(LOD)和定量限(LOQ)，结果见表2。

表2 线性方程、线性范围、相关系数、LOD和LOQ

2.3.2 精密度试验 精密吸取“2.2.1”项下对照品储备液适量混合，按“2.1.1”和“2.1.2”项下条件进样分析，连续进样6次。结果显示，尿嘧啶、鸟嘌呤、黄嘌呤、β-胸苷、尿苷、2′-脱氧腺苷、2′-脱氧鸟苷、肌苷、鸟苷峰面积的RSD值分别为1.1%、1.3%、1.1%、1.5%、1.2%、1.9%、1.4%、1.2%、1.5%，表明该仪器精密度良好。

2.3.3 重复性试验 精密称取同一批金银花样品6份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，然后按“2.1.1”和“2.1.2”项下条件进行分析并计算各成分的质量分数。结果显示，尿嘧啶、鸟嘌呤、黄嘌呤、β-胸苷、尿苷、2′-脱氧腺苷、2′-脱氧鸟苷、肌苷、鸟苷峰质量分数的RSD值分别为2.1%、1.8%、1.6%、2.5%、2.2%、1.9%、2.4%、1.8%、2.1%，表明该方法重复性良好。

2.3.4 稳定性试验 精密吸取同一份金银花的样品溶液，按“2.1.1”和“2.1.2”项下条件，分别于0、4、8、10、12、24 h进样测定，测得尿嘧啶、鸟嘌呤、黄嘌呤、β-胸苷、尿苷、2′-脱氧腺苷、2′-脱氧鸟苷、肌苷、鸟苷质量分数的RSD值分别为1.2%、1.1%、1.4%、1.2%、1.5%、0.9%、1.3%、1.1%、1.6%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.3.5 加样回收率试验 精密称定同一批已知含量的金银花样品6份，加入适量各对照品溶液，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，然后按“2.1.1”和“2.1.2”项下条件进行测定，记录各成分的峰面积并计算加样回收率。结果显示，尿嘧啶、鸟嘌呤、黄嘌呤、β-胸苷、尿苷、2′-脱氧腺苷、2′-脱氧鸟苷、肌苷、鸟苷的平均加样回收率分别为100.5%、102.1%、99.4%、101.2%、100.5%、99.9%、100.3%、102.1%、99.6%，RSD值分别为1.7%、1.9%、2.4%、2.2%、2.5%、2.5%、2.7%、2.1%、2.6%。

2.4 样品测定 准确称取5批样品，按“2.2.2”项下方法制备供试样品溶液，按“2.1.1”和“2.1.2”项下条件测定，总离子流图见图19，结果见表3。

图19 河南新乡样品总离子流图

表3 5批样品中9种核苷成分含量(μg·g-1，n=3)

3 讨论

本试验结果表明，金银花水提液中的核苷类成分主要为尿嘧啶、鸟嘌呤、黄嘌呤、β-胸苷、尿苷、2′-脱氧腺苷、2′-脱氧鸟苷、肌苷、鸟苷等，尤以鸟苷和尿苷含量较高。此外，金银花水提液中尚含有胸腺嘧啶、腺苷、环磷酸鸟苷等，但上述3种成分的含量远低于检测的线性范围，故未做结果展示。

本研究收集了5批金银花样品，由结果可见不同区域产的金银花中核苷类成分的含量未见显著差异，表明河南、河北、山东、安徽等道地产地产的金银花质量较稳定。并建立了UPLC-QQQ-MS/MS同时测定金银花饮片水提液中核苷类成分含量的方法。该方法简单、快速、准确、可靠，可用于金银花的品质鉴定和质量控制。同时，亦可为金银花的进一步合理利用与产品开发提供理论支撑。