低温预处理对不同储存时间黄帚橐吾种子发芽的影响

任钊江，王玉琴，王宏生，宋梅玲

(1.青海大学农牧学院，青海 西宁 810016；2.青海大学畜牧兽医科学院(青海省畜牧兽医科学院)，青海 西宁 810016)

种子萌发是种子植物生活史中实现种群更新和物种延续的关键环节之一[1]。植物种子发芽能力是其价值的重要体现。种子萌发期和幼苗建植期易受外界环境的影响，导致其死亡率较高[2]。种子能否成功发芽并定植是其种群更新的重要因素[3]。植物种子发芽能力受多种环境因素的影响，其中温度是影响发芽能力的重要因素，由于温度影响种子内部各种酶的活性，进而影响种子内部物质的转运以及种子和外界的物质交换，温度过高或过低都不利于种子萌发[4]。种子萌发及萌发后的生长状况受温度条件的影响，其萌发所需的最适温度往往与其起源地生态条件和所处的生存环境有关[5]。因此，研究温度对种子萌发的影响对于明确其在特定生长环境中的发芽和生长机制具有重要意义。

尽管种子可在较大的温度范围内完成萌发过程，但低温处理后，种子的休眠状态和发芽特征等却有显著差异[6]。种子休眠是指在预定的时间范围内本该有生命活力体征的种子，在预计正常、利于种子萌发的一些环境因子的组合条件下，不能按期正常萌发的一种生物现象[7]。休眠是植物的一种生存策略，不但可以为种子的传播以及扩散争取时间，还能促使种子在合适环境条件下萌发，可以有效地调节种子萌发的时空分布[8]。种子休眠对于植物而言是有利的生态适应特征，但却成为人工育种的主要障碍，需要较长时间或者复杂的催芽方法才可令种子萌发，给草业生产造成一定程度的困难[9]。因此，寻找有效打破种子休眠的方法具有重要的现实意义。解除种子休眠的方法有多种：用物理方法去除种皮的硬实性，减少种皮对发芽的障碍，提高种子发芽率；化学物质和激素刺激种子发芽；清水漂洗和光照处理解除休眠；低温层积加快种子后熟，促进种子发芽等[8-9]。有研究报道，适当的低温预处理能够打破种子休眠，提高萌发率[6]。运用低温预处理的方法，研究种子发芽率和幼苗生长的变化，有利于探究和揭示植物种子的萌发机制。

青藏高原高寒草甸是我国高山草原的典型代表，具有温度低、相对湿度高、生长季节短等特征[10]。黄帚橐吾(Ligulariavirgaurea)是菊科、橐吾属多年生灰绿色草本植物，是一种对高寒草甸有着严重危害的毒害草，是高寒草地退化的标志性有毒植物之一[11]，在青藏高原有着极强的入侵能力，对草地生产力和畜牧业发展造成了严重的影响[12]。黄帚橐吾体内可以产生特殊挥发物质，如萜类物质，抑制草原上其他植物种子的萌发及生长，使原本正常的草原退化，且其无性繁殖能力强大，如根茎繁殖，最终形成黄帚橐吾的单优势种群[12]。有研究发现，黄帚橐吾种子在较大的温度范围内均可萌发，且光照、种子大小等均会对黄帚橐吾种子的萌发和幼苗生长产生不同程度的影响[13-14]，也有研究发现黄帚橐吾种子的萌发率不高[4,13]，具体原因可能是种子休眠难以被打破，也可能是种子萌发期间对外界环境条件过于敏感[15]。本研究以黄帚橐吾种子为对象，通过模拟高寒环境低温或超低温的条件，观察黄帚橐吾种子萌发率、萌发速度和萌发后幼苗生长的变化，研究不同低温预处理对黄帚橐吾种子萌发的影响，以期为毒害草型退化草地治理以及黄帚橐吾的有效防除提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 种子来源

供试种子来自于青海省海北藏族自治州海晏县青海湖乡达玉德吉村(N 37°4′1″，E 100°52′48″)，海拔3 230 m，气候属高原大陆性气候，年均气温0.2～3.4 ℃，年均降水量277.8～499.5 mm，降水多集中在5-9月，年均日照2 580～2 750 h。草地类型以草甸化草原为主，以线叶嵩草(Kobresiacapillifolia)、矮嵩草(K.humilis)、垂穗披碱草(Elymusnutans)为主要建群种，伴生种为高原早熟禾(Poaalpigena)、中华羊茅(Festucasinensis)、扁蓿豆(Melissitusruthenica)等，牧草生长期4-5个月，土壤以高山草甸土为主。种子采集时间为2018年9月底和2019年9月底，两次均于同一地点采集，采集区域面积为1.0 hm2，随机采集种子，将黄帚橐吾花序剪下装入样袋，置于实验室风干后手动将种子脱落，室温下储藏，温度约为20 ℃。

1.2 试验设计

于2020年1月初进行室内发芽试验，观察不同温度预处理后黄帚橐吾种子萌发能力的变化。

本试验设置了2个温度预处理，分别为-20 ℃和4 ℃，-20 ℃下的种子处理时间分别为0.5、1和2 h，4 ℃下的种子处理时间分别为24、48和72 h。使用TP法进行种子萌发试验，培养皿(直径为9 cm)内放置2层干燥滤纸，用装有蒸馏水的注射器润湿滤纸，每个培养皿放置50粒种子。每个处理设置4个重复。置于光照培养箱中，变温15～25 ℃(10 h/14 h)条件下培养，光照强度3 000 lx。试验期间始终保持滤纸湿润，并且每天记录发芽种子数，试验时间为17 d。最后，每个培养皿内随机选取5株幼苗，测定并记录根长(胚根延伸长度)和苗长(胚芽延伸长度)，计算发芽指数和发芽率。

发芽指数：GI=∑(Gt/Dt)

式中，Gt为在时间t日的发芽数，Dt为相应的发芽天数[16]。

1.3 统计分析

所有数据均采用Excel计算并作图，使用SPSS 20.0软件进行统计分析。相同年份，不同处理之间的发芽指数、发芽率、根长和苗长的差异显著性采用单因素方差分析方法进行检验。不同年份，相同处理之间的发芽指数、发芽率、根长和苗长的差异显著性采用独立样本T检验，显著性区间定义为95%水平。

2 结果与分析

2.1 4 ℃预处理对黄帚橐吾种子发芽率与发芽指数的影响

2018年采集的黄帚橐吾种子经过4 ℃预处理24、48和72 h后发芽率与对照相比均有所提高(图1)，其中，24 h处理下达到显著水平(P<0.05)。2019年采集的黄帚橐吾种子经过4 ℃预处理24和48 h后，其发芽率显著高于对照，处理72 h后种子发芽率与对照无显著差异(P>0.05)。2019年采集的黄帚橐吾种子发芽率在各处理时间下均显著高于2018年采集的种子(P<0.05)。

图1 4 ℃预处理下黄帚橐吾种子发芽率Fig.1 Germination rate of Ligularia virgaurea seeds pretreated at 4 ℃注：*表示不同年份之间差异显著(P<0.05)，不同小写字母表示2018年种子在不同处理时间之间差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示2019年种子在不同处理时间之间差异显著(P<0.05)。下同

采于2018年的黄帚橐吾种子经过4 ℃预处理24 h和48 h后，其发芽指数与对照之间差异不显著(P>0.05)，而处理72 h后发芽指数显著低于对照(P<0.05)(图2)。2019年采集的黄帚橐吾种子经4 ℃处理24 h后与对照差异不显著，处理48、72 h后，发芽指数显著低于对照(P<0.05)。2019年采集的黄帚橐吾种子发芽指数高于2018年采集的种子，而经过4 ℃预处理后2个年份之间差异不显著(图2)。

图2 4 ℃预处理下黄帚橐吾种子发芽指数Fig.2 Germination index of Ligularia virgaurea seeds pretreated at 4 ℃

2.2 4 ℃预处理对黄帚橐吾种子根长与苗长的影响

采于2018、2019年的黄帚橐吾种子经过4 ℃预处理24 h后，其幼苗根长与对照差异不显著(P>0.05)，而处理48 h和72 h后，其根长显著低于对照(P<0.05)(图3)。2019年采集的黄帚橐吾种子根长在各处理时间下均显著高于2018年采集的种子(P<0.05)。

图3 4 ℃预处理下黄帚橐吾种子根长Fig.3 Root length of Ligularia virgaurea seeds pretreated at 4 ℃

2018年采集的黄帚橐吾种子经过4 ℃预处理24、48 h后，种子苗长相比于对照没有显著差异(P>0.05)，处理72 h后，其苗长显著低于对照(P<0.05)(图4)。采于2019年的黄帚橐吾种子经过4 ℃预处理24、48和72 h与对照相比均显著降低(P<0.05)。2019年采集的黄帚橐吾种子苗长显著高于2018年，经过4 ℃预处理后2个年份间无显著差异(图4)。

图4 4 ℃预处理下黄帚橐吾种子苗长Fig.4 Seedling length of Ligularia virgaurea seeds pretreated at 4 ℃

2.3 -20 ℃预处理对黄帚橐吾种子发芽率与发芽指数的影响

2018年采集的黄帚橐吾种子经过-20 ℃预处理0.5、1和2 h 后发芽率与对照相比无显著变化(P>0.05)。而2019年采集的种子经过-20 ℃处理0.5、1和2 h后发芽率均显著高于对照(P<0.05)。2019年采集的黄帚橐吾种子发芽率在各处理下均显著高于2018年采集的种子(图5)。

图5 -20 ℃预处理下黄帚橐吾种子发芽率Fig.5 Germination rate of Ligularia virgaurea seeds pretreated at -20 ℃

2018年与2019年采集的黄帚橐吾种子经过-20 ℃预处理0.5 、1和2 h后发芽指数与对照相比均无显著差异(P>0.05)。2019年采集的黄帚橐吾种子发芽指数高于2018年采集的种子(P<0.05)，而经过-20 ℃预处理后，二者之间无显著差异(图6)。

图6 -20 ℃预处理下黄帚橐吾种子发芽指数Fig.6 Germination index of Ligularia virgaurea seeds pretreated at -20 ℃

2.4 -20 ℃预处理对黄帚橐吾种子根长与苗长的影响

采于2018年和2019年的黄帚橐吾种子经过-20 ℃预处理0.5、1和2 h后幼苗的根长与对照相比均无显著变化(P>0.05)。在各处理下，2019年采集的黄帚橐吾根长均显著高于2018年采集的种子(P<0.05)(图7)。

2018年采集的黄帚橐吾种子经过-20 ℃预处理0.5 h后种子苗长与对照相比显著提高(P<0.05)(图8)，处理1 h和2 h后相比于对照没有显著差异。2019年黄帚橐吾种子经过-20 ℃预处理0.5 h和1 h后相比于对照没有显著差异(P>0.05)，处理2 h后相比对照显著降低。2019年采集的黄帚橐吾的苗长显著高于2018年(P<0.05)，但是经过-20 ℃预处理后，2个年份之间差异不显著(图8)。

图7 -20 ℃预处理下黄帚橐吾种子根长Fig.7 Root length of Ligularia virgaurea seeds pretreated at -20 ℃

图8 -20 ℃预处理下黄帚橐吾种子苗长Fig.8 Seedling length of Ligulariavirgaurea seeds pretreated at -20 ℃

3 讨论

温度过低，会抑制种子内酶的结构和代谢，从而影响酶的活性，最终抑制种子的正常代谢和发芽[17-18]、延长种子萌发时间[19]，但低温也可打破种子的热休眠，促进种子萌发[20]。在不同情况下，低温对种子发芽造成的影响也不同。本研究中黄帚橐吾种子的发芽率普遍不高，与之前的研究结果一致[4,21]，这或许与黄帚橐吾种子自身的保护机制有关系[22]。也有研究结果证明，在生境不适宜种子萌发时，黄帚橐吾种子可能存在选择性休眠，一部分随着扩散媒介散播到其他生境中，而没有扩散的种子当环境一旦适宜时就会萌发[14]。温度的变化能促进种子胚的发育，进而提高种子的萌发率[23]。本研究中无论是4 ℃预处理还是-20 ℃预处理均提高了黄帚橐吾种子的发芽率，这可能是由于低温预处理增加了黄帚橐吾种子的活力或促进了种子胚的发育，进而提高其发芽率，这是黄帚橐吾种子长期在高寒环境下生存而产生的适应性机制。另一方面，采于2019年的黄帚橐吾种子的发芽率普遍高于采自2018年的种子，有研究表明，黄帚橐吾种子储存时间越长，萌发率越低[14]，本研究与之一致。另外，2018年生长季降水量低于2019年，因此，同一时间采集的种子，2个年份之间的成熟度存在差异，这也是不同年份间黄帚橐吾种子发芽率有差异的原因之一。

发芽指数是发芽率指标的细化和深化，它放大了种子活力的特征[24]。本研究中，随着4 ℃预处理时间的延长，黄帚橐吾种子的发芽指数逐渐降低，虽然短时间的低温刺激会使种子焕发出活力，然而长时间的低温预处理则使发芽的周期延长，但黄帚橐吾的种子仍然具有活力并最终萌发，这为其在多变的环境条件下的生存和扩张提供了保障[14]。前人的研究也发现低温会延长种子的萌发持续时间[14,19]，这是黄帚橐吾种子长期适应高寒环境形成的机制，通过延长种子的萌发周期确保在草地中占据更大的生存空间。对于不同年份采集的种子，本研究发现对照条件下2019年的黄帚橐吾种子的发芽指数高于2018年，而经过4 ℃与-20 ℃预处理后，两个年份之间差异不显著，表明黄帚橐吾种子储存时间越长，种子的萌发活力可能越低，与之前的研究结果一致[14]。但是，低温预处理对于长时间储存的黄帚橐吾种子，起到了提高其萌发活力的作用，进而在萌发速度上减少了与新鲜种子之间的差距。

在植物一生中，种子萌发后的生长情况对植物后期的建植至关重要[13]，种子萌发后其根长和苗长随着外界环境胁迫强度的增加而降低[25]。之前的研究结果表明，植物种子的萌发和幼苗生长发育会因浸种初始温度的不同而不同[26]。本研究发现经过4 ℃低温处理后，随着处理时间的延长，黄帚橐吾种子萌发后其根长和苗长均呈现降低的趋势，而-20 ℃处理后，黄帚橐吾幼苗的根长和苗长与对照相比差异不大，甚至高于对照，这是由于黄帚橐吾种子连续处于低温环境下(24、48或72 h)，其萌发和生长活力受到了影响，种子根长和苗长随着外界环境胁迫强度的增加而降低[13]，而-20 ℃处理虽然温度达到极低状态，但处理时间不长(0.5、1或2 h)，与其高寒的生存环境相近，一旦条件适宜，黄帚橐吾种子的发芽和生长还可能受到一定的促进。这与黄帚橐吾长期在高寒环境下生存形成的生存机制有关。值得注意的是，2019年采集的种子在-20 ℃预处理后，其苗长有所降低，这可能主要由于新采集的种子还未经过足够时间的后熟等过程，应对外界环境突然变化的能力仍未发育完全，不能为幼苗的生长提供足够的养分。因此，黄帚橐吾种子的萌发与生境的气候、土壤、生长年份等均有密切联系，具体的机制仍需要进一步研究。

4 结论

综上所述，低温预处理可以提高黄帚橐吾种子的发芽率；短期的低温处理对于黄帚橐吾幼苗的生长有促进作用，对发芽指数影响不大；而低温处理时间过长，则会对种子的发芽指数和幼苗的生长产生不利的影响；存储时间越长，黄帚橐吾种子的萌发活力越低，但是，一定的低温预处理能减缓存储时间造成的影响。这对于黄帚橐吾种群在高寒草地群落中的长期生存和扩张可能发挥了有利作用。