Necrostatin-1对急性高眼压大鼠模型中视网膜神经节细胞程序性坏死的抑制作用

景原媛 马伊 王凯 刘竹青

天津市人民医院眼科，天津300121

青光眼是一种神经退行性、不可逆性致盲眼病，其主要特点为视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells，RGCs)的进行性丢失。急性青光眼患者眼压急剧大幅度升高可引起视网膜的缺血-再灌注损伤，缺血致细胞死亡的方式包括凋亡和坏死，既往对青光眼的研究多集中在RGCs凋亡及其机制上。程序性坏死是一种新发现的由死亡受体介导的caspases非依赖的调控细胞死亡的方式，在急性心肌梗死、脑出血等缺血性损伤过程中发挥重要作用。在缺血状态下，因ATP消耗，细胞凋亡被抑制，感光细胞的死亡类型由细胞凋亡向受体相互作用蛋白激酶1(receptor interacting protein kinase 1，RIPK1)介导的程序性坏死转变。因此，抑制RGCs程序性坏死可能成为治疗青光眼的新策略。胶质细胞参与RGCs微环境的调节，当视网膜遭受高眼压损伤时，胶质细胞活化进而上调炎性因子表达，起到免疫调节作用。程序性坏死可由肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、TNF相关凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)、凋亡相关因子配体(factor associated suicide ligand，FasL)等炎性因子诱导。小分子化合物necrostatin-1(Nec-1)可以通过抑制RIPK1磷酸化进而抑制其活性和程序性坏死的发生，是程序化坏死的特异性抑制剂。目前程序性坏死与胶质细胞活化之间的关系尚不明确，Nec-1对因眼压急剧升高导致视网膜缺血-再灌注损伤进而引起的RGCs程序性坏死和视网膜胶质细胞活化的作用需要进一步研究。本研究拟探讨Nec-1对急性高眼压大鼠RGCs程序性坏死的影响，以期为青光眼的临床治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料

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实验动物及分组 选取健康无眼疾雄性6～8周龄SD大鼠24只，体质量250～300 g，由中国食品药品检定研究院提供，于22～26 ℃、相对湿度60%～80%动物房内饲养，7：00-19：00进行灯光照射，定时通风换气，自由饮食。正式实验前于常规标准环境中适应性饲养1周。采用随机数表法将24只雄性SD大鼠随机分为正常对照组、模型对照组、Nec-1处理组和阴性对照组，每组6只。实验动物的使用遵循国家科学技术委员会颁布的《实验动物质量管理办法》要求，本研究经天津市人民医院实验伦理委员会批准[批文号：(2017)年快审第(C01)号]。

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主要试剂及仪器 Nec-1(A4213，美国APExBIO公司)；兔抗大鼠胸腺细胞抗原1(thymocyte antigen-1，Thy-1)多克隆抗体(A16986，武汉爱博泰克生物科技公司)；二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)溶剂(美国Sigma公司)；兔抗大鼠胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)多克隆抗体(ab7260，美国Abcam公司)；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG二抗(GK600705A，上海基因科技股份有限公司)。眼科手术显微器械、手术显微镜(苏州六六视觉科技股份有限公司)；包埋机EG116、石蜡切片机(德国Leica公司)；光学显微镜、光学显微数码成像系统(日本Olympus公司)。

1.2 方法

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实验大鼠的分组处理 正常对照组大鼠不做任何处理，其余3个组均制作急性高眼压缺血-再灌注模型。造模第2天，扩瞳检查大鼠眼部情况，剔除前房出血、晶状体损伤、玻璃体积血和视网膜脱离大鼠，并补齐至每组6只。模型对照组仅造模；Nec-1处理组大鼠造模后即刻在光学显微镜下使用微量注射器给予玻璃体腔内注射终浓度为4 mmol/L的Nec-1 DMSO溶液2 μl；阴性对照组以同法注射DMSO 2 μl。

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急性高眼压缺血-再灌注模型的制作 参照Büchi等的方法，采用质量分数10%水合氯醛3.5 ml/kg腹腔内注射麻醉后，固定大鼠四肢及头部，将带有31G BD针头的注射器与含500 ml质量分数0.9%氯化钠注射液输液瓶相连，针头自鼻上方向角膜中心穿入大鼠左眼前房，调节输液瓶高度使液面与大鼠角膜缘垂直距离为150 cm，即造成相当于110 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)的高眼压，连续维持高眼压60 min后降低输液瓶高度至大鼠眼球水平，拔出前房灌注针头，恢复视网膜血供。

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眼球切片的制作 造模后7 d，各组大鼠腹腔内注射10%水合氯醛麻醉后打开胸腔，暴露心脏，经左心室灌注0.9%氯化钠溶液，并以质量分数4%多聚甲醛溶液灌注固定心脏10 min，迅速摘取术眼眼球置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，石蜡包埋后视盘旁0.5 mm处制作5 μm厚切片，60 ℃烤片20 min，备用。

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苏木精-伊红染色法观察视网膜结构 取1.2.3制作的各组眼球相同部位连续3张切片行常规苏木精-伊红染色，光学显微镜下观察切片后极部中点连续3个视野视网膜结构并拍照。

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免疫组织化学染色法检测视网膜中Thy-1的表达 取1.2.3制作的各组眼球相同部位连续3张视网膜切片，常规脱蜡、水化，滴加质量分数3%过氧化氢封闭内源性过氧化物酶。将切片放入pH 6.0柠檬酸缓冲液后置于微波炉内高火加热3 min后停火，微波炉内静置5 min，再重复此步骤1次；随后中低火加热1 min后停火，微波炉内静置5 min；切片自然冷却后置于磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution，PBS)中浸洗2次，每次3 min；置于体积分数10%山羊血清溶液室温封闭30 min；滴加兔抗大鼠Thy-1多克隆抗体(1∶ 100)；4 ℃湿盒孵育过夜，PBS浸洗3次，每次3 min；滴加辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG二抗，室温孵育30 min，PBS洗涤3次，每次5 min；二氨基联苯胺(diaminobenzidine，DAB)显色10 s～3 min，苏木素复染，封片。每张切片在200倍光学显微镜下于后极部中点对称选择5个视野采集图像并拍照，细胞核或细胞质呈黄褐色染色为Thy-1免疫阳性细胞。

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免疫组织化学染色法检测视网膜中GFAP的表达 取1.2.3制作的各组眼球视网膜切片，每只眼球随机取4张切片，常规脱蜡、水化，滴加体积分数3%过氧化氢封闭内源性过氧化物酶。将切片放入pH 6.0柠檬酸缓冲液后置于微波炉内，抗原修复20 min；自然冷却后蒸馏水清洗2次，每次3 min，PBS浸洗2次，每次3 min；置于10%山羊血清溶液室温封闭30 min；滴加兔抗大鼠GFAP多克隆抗体(1∶ 1 000)；4 ℃湿盒孵育过夜，PBS浸洗3次，每次3 min；滴加辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG二抗(1∶ 100)，室温孵育30 min，DAB显色3 min，苏木素复染，封片。GFAP阳性染色为棕黄色。每张切片随机取4个视野采集图像，采用ImageJ软件分析图像，计算平均积分吸光度值。

1.3 统计学方法

采用SPSS 16.0统计学软件进行统计分析。各组测量指标的数据资料经Shapiro-Wilk检验证实呈正态分布，以表示。经Levene检验证实方差齐，组间总体差异比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-

t

检验。

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<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠视网膜组织结构比较

苏木精-伊红染色结果显示，正常对照组视网膜结构清晰，RGCs层排列紧密，各层结构未发生明显改变。与正常对照组比较，模型对照组和阴性对照组神经纤维层变薄，RGCs层细胞排列疏松，内核层细胞减少、排列紊乱，外核层细胞正常或变大；与正常对照组比较，Nec-1处理组视网膜神经纤维层略薄，RGCs排列整齐、较疏松，视网膜层数无明显变化，细胞数量较少。与模型对照组和阴性对照组比较，Nec-1处理组神经纤维层厚度增加，RGCs数量较多、排列整齐(图1)。

图1 各组大鼠视网膜组织结构变化(HE ×400，标尺=100 μm) A：正常对照组视网膜各层结构正常 B：模型对照组神经纤维层变薄，RGCs数量减少、排列疏松 C：阴性对照组神经纤维层变薄，RGCs数量减少、排列疏松 D：与模型对照组比较，Nec-1处理组神经纤维层厚度增加，RGCs数量较多、排列整齐Figure 1 Histopathological staining of rat retinas (HE ×400,bar=100 μm) A:Rat retinal structures of normal control group were normal B:The nerve fiber layer of rats in model control group was thinner;the number of RGCs decreased and the arrangement was loose C:The nerve fiber layer of rats in negative control group was thinner;the number of RGCs was reduced and the arrangement was loose D: Compared with model control group,the nerve fiber layer was thickened,and the number of RGCs was increased,and the arrangement of RGCs was more regular in Nec-1 treatment group

2.2 各组大鼠视网膜Thy-1表达情况比较

免疫组织化学染色结果显示，Thy-1免疫反应主要存在于神经纤维层及RGCs层，部分内核层也可见Thy-1免疫阳性反应。模型对照组和阴性对照组Thy-1阳性染色较正常对照组明显减弱，Nec-1处理组Thy-1阳性染色较模型对照组明显增强。模型对照组大鼠视网膜Thy-1阳性RGCs数量较正常对照组明显减少，Nec-1处理组大鼠视网膜Thy-1阳性RGCs数量较模型对照组明显增多(图2)。

图2 各组大鼠Thy-1染色阳性RGCs情况(DAB ×200，标尺=50 μm) Thy-1免疫反应阳性RGCs的细胞核或细胞质呈黄褐色染色 A：正常对照组大鼠视网膜呈Thy-1阳性染色 B：模型对照组Thy-1染色明显减弱 C：阴性对照组Thy-1染色明显减弱 D：Nec-1处理组Thy-1染色明显增强Figure 2 Thy-1 staining of rat RGCs (DAB ×200,bar=50 μm) The nuclei or cytoplasm of Thy-1 staining-positive RGCs were yellow-brown staining A:Rat retinas of normal control group were Thy-1 staining-positive B:Thy-1 staining of model control group was significantly weakened C:Thy-1 staining of negative control group was significantly attenuated D:Thy-1 staining of Nec-1 treatment group was significantly enhanced

2.3 各组大鼠视网膜GFAP表达比较

免疫组织化学染色结果显示，正常对照组大鼠视网膜GFAP在神经纤维层呈弱阳性表达。与正常对照组比较，模型对照组、阴性对照组和Nec-1处理组GFAP在神经纤维层、RGCs层、内丛状层、内核层有阳性丝状染色，呈强阳性表达。与模型对照组和阴性对照组比较，Nec-1处理组GFAP在视网膜各层表达减弱(图3)。各组GFAP平均积分吸光度值总体比较差异有统计学意义(

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=24.675，

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<0.001)，其中与正常对照组比较，模型对照组、阴性对照组和Nec-1处理组GFAP平均积分吸光度值明显升高；Nec-1处理组GFAP平均积分吸光度值较模型对照组和阴性对照组明显降低，差异均有统计学意义(均

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<0.05)(表1)。

图3 各组大鼠视网膜GFAP表达情况(DAB ×400，标尺=100 μm) GFAP阳性染色为棕黄色 A：正常对照组GFAP在神经纤维层有弱阳性表达 B：模型对照组GFAP表达较正常对照组明显增加 C：阴性对照组GFAP表达较正常对照组明显增加 D：Nec-1处理组视网膜各层散在表达GFAPFigure 3 Expression of GFAP protein in rat retinas(DAB ×400,bar=100 μm) Positive staining of GFAP protein was brownish yellow A:Weak expression of GFAP was found in the nerve fiber layer of normal control group B:Significantly increased expression of GFAP than normal control group was found in model control group C:Significantly increased expression of GFAP than normal control group was found in negative control group D:Scattered expression of GFAP was found in various layers of Nec-1 treatment group

表1 各组大鼠视网膜细胞中GFAP平均积分吸光度值比较(x±s)Table 1 Comparison of integrated absorbance values of GFAP protein in rat retinal cells among various groups (x±s)组别样本量GFAP的平均积分吸光度值正常对照组647.209±15.311模型对照组6116.220±18.194a阴性对照组6116.382±19.020aNec-1处理组692.818±10.236abcF值24.675P值<0.001 注:与正常对照组比较,aP<0.05;与模型对照组比较,bP<0.05;与阴性对照组比较,cP<0.05(单因素方差分析,LSD-t检验) GFAP:胶质原纤维酸性蛋白 Note:Compared with normal control group,aP<0.05;compared with model control group,bP<0.05;compared with negative control group,cP<0.05 (One-way ANOVA,LSD-t test) GFAP:glial fibril-lary acidic protein;Nec-1:necrostatin-1

3 讨论

程序性坏死是一种受调控的细胞坏死机制，已有研究表明程序性坏死在缺血-再灌注损伤、炎症、神经退行性病变等多种疾病中发挥重要作用。程序性坏死是由RIPK1和RIPK3相互作用形成坏死小体向下游传导信号完成的。Nec-1是程序性坏死的特异性阻断剂，可以通过抑制RIPK1和RIPK3相互作用阻止坏死小体形成，从而达到保护神经的作用。越来越多的研究表明，程序性坏死参与了青光眼等缺血性相关眼病。Do等研究发现，RIPK1抑制复合物对青光眼大鼠模型RGCs缺血损伤有保护作用。彭亚力等认为，对前房灌注致缺血-再灌注损伤的小鼠行Nec-1预处理可以阻断RGCs坏死性凋亡。Thy-1抗原是存在于啮齿类动物多类细胞表面的一种糖蛋白，被认为是成熟RGCs的标志。Dabin等研究发现，Müller细胞的纯培养物被Thy-1抗体强烈标记，视网膜神经元缺失后，Müller细胞可以表达Thy-1。本研究发现，Thy-1免疫反应主要存在于神经纤维层及RGCs层，部分内核层也有Thy-1免疫阳性反应。正常对照组可见RGCs细胞核或细胞质Thy-1染色明显，而模型对照组Thy-1染色阳性的RGCs数量明显减少；经玻璃体腔内注射Nec-1处理后，Thy-1染色阳性的RGCs数量较模型对照组明显增加，说明Nec-1可以抑制急性高眼压大鼠RGCs的减少，程序性坏死参与了急性高眼压的病理过程。

胶质细胞是一类重要的视网膜细胞，可以调节神经元活性，影响神经元在各种损伤中的存活。胶质细胞活化是视网膜损伤后常见的现象，但活化的胶质细胞在视网膜中的确切功能尚不明确。有研究表明，活化的胶质细胞可以释放大量炎性介质，引起神经元损伤。GFAP是一种骨架蛋白，其过度表达是视网膜星形胶质细胞和Müller细胞反应性活化的重要标志，是神经系统对各种损伤的必要反应。凌志红等研究表明，在慢性高眼压模型建立后12 h，GFAP在星形胶质细胞的表达开始增加，同时Müller细胞也开始表达GFAP，提示在慢性高眼压模型建立后12 h星形胶质细胞及Müller细胞即呈现活化状态，于造模后4周达高峰，造模后8周活化水平开始降低。Zhang等研究发现，在高眼压模型大鼠眼压急性升高后第1天视网膜神经纤维层及RGCs层即有GFAP表达，并持续至第4周，同时观察到视网膜中胶质细胞活化发生的时间比RGCs的丢失明显较早。张绍丹等研究也证实，急性眼压升高早期即可引起RGCs丢失及轴突变性，视觉神经元改变的同时伴随胶质细胞的活化。本研究中大鼠急性眼压升高后7 d，视网膜GFAP表达上调，胶质细胞活化；玻璃体腔内注射Nec-1后视网膜GFAP的表达及胶质细胞活化减少，说明程序性坏死参与了视网膜胶质细胞活化。程序性坏死可以在TNF-α、TRAIL、FasL等炎性因子存在情况下被介导激活。当视网膜受到缺血等损伤时，胶质细胞的免疫调节作用使炎性因子表达上调。TNF-α作为星形胶质细胞及Müller细胞的主要免疫产物，是程序性坏死的主要诱导剂，进一步引起视网膜细胞死亡，造成级联放大作用，加重视网膜细胞损伤。本研究仅证明急性高眼压损伤后，Nec-1可以抑制视网膜胶质细胞的活化，但其通过何种途径调控仍需进一步研究。目前有研究表明，中枢神经系统程序性坏死通路可能通过调控Toll样受体4/核因子κB(Toll-like receptor 4/nuclear factor kappa B，TLR4/NF-κB)途径参与小胶质细胞活化。Ni等研究认为，持续性大脑中央动脉闭塞或葡萄糖剥夺使RIPK1、RIPK3和RIPK1-RIPK3复合物增加，进而引起神经元及星形胶质细胞死亡。以上中枢神经系统中程序性坏死与胶质细胞活化之间的调控机制研究可为急性高眼压视网膜细胞程序性坏死的机制研究提供一些启示。

综上所述，本研究结果表明Nec-1可以抑制急性高眼压大鼠RGCs死亡，减少GFAP的表达，对急性高眼压大鼠RGCs程序性坏死具有抑制作用。目前关于青光眼程序性坏死具体分子机制的研究尚少，视网膜作为视神经系统的延续，Nec-1是通过何种途径减轻急性高眼压后视网膜的炎症反应和胶质细胞活化仍需进一步研究。

利益冲突

所有作者均声明不存在任何利益冲突

作者贡献声明

景原媛：设计实验、实施研究、文稿书写；马伊：参与选题、指导实验、对文稿审阅修改及定稿；王凯：实施研究、审阅文稿；刘竹青：实施研究