跨膜蛋白26在视网膜中的特异表达及其与原发性开角型青光眼的关系

尹燚 冒瑶 杨正林 黄璐琳

电子科技大学医学院 四川省人民医院医学检验中心 人类疾病基因研究四川省重点实验室，成都610072

膜蛋白是一种功能性蛋白，在生物体内承担着十分重要的作用，参与细胞增生分化、生长代谢、物质交换和能量转化等生物过程。根据蛋白在膜上分离的难易程度，可将膜蛋白分为膜整合蛋白、膜锚定蛋白和外在膜蛋白。跨膜蛋白是膜整合蛋白的一种，在生物体内起着信号转导、小分子物质或离子跨膜转运等作用，其至少存在一段跨膜结构，因此将跨膜蛋白结构分为跨膜区、胞膜外区和胞质区，其结构对蛋白的功能具有重要作用。跨膜蛋白26基因(transmembrane protein 26 gene，

TMEM26

)是含有6个外显子的编码跨膜蛋白的基因，在人和小鼠中均有表达，且均位于10号染色体上，该基因编码一段相对分子质量约为41 600的多次跨膜蛋白。目前，已证明

Tmem26

在小鼠的胚胎中表达，且受时间和空间的调控；该基因在乳腺癌细胞中表达，其蛋白结构对细胞药物治疗应答存在影响；该基因也在气道上皮和肺实质细胞中表达，是与肺功能下降、慢性阻塞性肺病发病机制相关的候选基因；TMEM26也被鉴定为一种米色脂肪细胞的表面标志物。虽然TMEM26已被报道在以上组织或细胞内表达，但其具体功能，尤其在眼中的作用及功能尚不清楚。青光眼是主要的致盲眼病之一，主要包括慢性闭角型青光眼、原发性开角型青光眼(primary open-angle glaucoma，POAG)和剥脱性青光眼等常见类型。视网膜神经节细胞(retinal ganglion cell，RGC)损失是青光眼的致病关键；内丛状层(inner plexiform layer,IPL)由RGC树突、双极细胞轴突和无长突细胞形成的纤维网状层组成，其厚度是评估POAG的潜在生物标志。本研究拟探讨TMEM26在视网膜中的表达情况，并根据本课题组已报道的数据探讨

TMEM26

基因变异与POAG的关联情况。

1 材料与方法

1.1 材料

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材料来源 选取SPF级21周龄健康C57BL/6小鼠5只，体质量为25～31 g，由江苏集萃药康生物科技股份有限公司提供，实验动物的喂养及使用均遵循《实验动物管理条例》。1个人眼球来自于遗体捐赠。本研究获四川省人民医院伦理委员会批准[批文号：伦审(研)2019年第36号]，人体标本的来源与使用均获得捐赠者家属签字同意。

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主要试剂及仪器 质量分数4%多聚甲醛通用型组织固定液(北京Biosharp公司)；质量分数30%蔗糖溶液、体积分数0.25% Triton X-100(北京索莱宝科技有限公司)；OCT冷冻切片包埋剂(美国Sakura公司)；兔抗TMEM26多克隆抗体(TA330777，美国Origene公司)；Isolenctin B4 594(英国MKBio公司)；体积分数5%山羊血清、Alexa Fluor 488标记山羊抗兔荧光二抗、DAPI、磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)(上海碧云天生物技术有限公司)。解剖显微镜(SZX10，日本Olympus公司)；显微解剖器械(深圳华阳生物技术有限公司)；冰冻切片机(BK-2318，山东博科生物产业有限公司)；恒温烘箱(DHP-9052，上海和呈仪器制造有限公司)；激光扫描共聚焦显微镜(LSM800，德国Carl Zeiss公司)。

1.2 方法

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蛋白跨膜结构预测 从UCSC(http://genome.ucsc.edu/)中获得人和小鼠的TMEM26氨基酸序列，将氨基酸序列输入MemBrain 3.0中，预测跨膜结构。

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免疫荧光染色法观察TMEM26在人和小鼠视网膜中的表达及定位 在解剖显微镜下剪去角膜，用4%多聚甲醛完全浸没眼球，固定2 h后用PBS洗去残留的多聚甲醛；在解剖显微镜下用镊子轻轻取出晶状体，将取出晶状体后的眼球用30%蔗糖浸没，脱水2 h，将其取出用OCT包埋剂包埋。将包埋好的组织置于-80 ℃冰箱，用于冰冻切片。切片制作完成后，将其在37 ℃烘箱中烘烤1 h，使组织切片完全固定于载玻片，用免疫组化笔圈出切片位置，使用含5%山羊血清和0.25% Triton X-100的PBS溶液封闭1 h；使用兔抗TMEM26多克隆抗体(1∶ 200)4 ℃避光孵育过夜；使用Alexa-488山羊抗兔二抗(1∶ 500)及DAPI避光孵育2 h；PBS清洗，封片后采用激光扫描共聚焦显微镜观察并拍照。

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免疫荧光双重染色法观察TMEM26与血管定位关系 参照1.2.2方法行TMEM26免疫荧光染色，进行视网膜Isolectin B4血管内皮细胞标记染色，加入Isolectin B4(1∶ 200)，4 ℃避光孵育过夜；用PBS冲洗10 min，封片后激光扫描共聚焦显微镜下观察并拍照，蓝色为DAPI，绿色为TMEM26，红色为视网膜血管。

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TMEM26

基因的SNP分析 与本课题组前期研究结果的数据进行比对，分析

TMEM26

在1 007例POAG患者与1 009个正常人的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)变异情况，总结数据，筛选出

P

<0.01的显著性变异。

1.3 数据处理

采用NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)和UCSC等网站查询

TMEM26

基因和蛋白的信息；通过MemBrain 3.0跨膜结构预测网站(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/MemBrain/)预测蛋白的跨膜结构。使用DNAMAN进行氨基酸序列比对，通过AI编辑跨膜蛋白图像。

2 结果

2.1 TMEM26跨膜结构

在UCSC中查询人TMEM26的氨基酸残基有368个，小鼠Tmem26的氨基酸残基有366个。将2种来源的TMEM26进行氨基酸序列比对，同源率为69.46%。人TMEM26蛋白包括8个疏水性跨膜结构域、4个亲水胞质结构域和5个亲水胞膜外区结构域；且有2个螺旋跨膜结构连接的亲水性胞质结构氨基酸残基数仅有2个，是小胞质结构域。小鼠Tmem26蛋白预测结果与人TMEM26相似，同样含有8个跨膜结构域、5个亲水胞膜外区结构域和4个亲水胞质结构域。人和小鼠TMEM26多肽链N-端和C-端均位于胞膜外，具有相似的跨膜结构域、胞膜外结构域和胞质结构域，整体跨膜结构相似。但两者的结构域氨基酸残基组成数存在细微差别，对于2个“背靠背”(back-to-back)螺旋跨膜结构，在人的TMEM26中，第1个back-to-back螺旋跨膜结构由E2-V30的29个氨基酸残基组成，第2个back-to-back螺旋跨膜结构由E33-K57的25个氨基酸残基组成；小鼠Tmem26中的2个back-to-back螺旋跨膜结构分别由E2-K31的30个氨基酸残基、H34-K57的24个氨基酸残基构成。此外，氨基酸残基数目差别最大的是位于多肽末端的胞膜外结构域，人的TMEM26比小鼠的Tmem26多2个氨基酸残基(图1，表1)。

图1 人与小鼠TMEM26的跨膜结构 蓝色所示为“背靠背”螺旋跨膜结构，黄色为非“背靠背”螺旋跨膜结构 A：人 B：小鼠Figure 1 Transmembrane structure of TMEM26 protein in human and mouse The color blue presented back-to-back transmembrane helices,and the color yellow showed non-back-to-back transmembrane helices A:Human B:Mouse

表1 TMEM26蛋白跨膜结构具体位置[12-16]Table 1 Specific amino acid sequences of transmembrane structure of TMEM26 protein人TMEM26蛋白跨膜结构 小鼠Tmem26蛋白跨膜结构氨基酸残基顺序位置氨基酸残基顺序位置1-1胞膜外区1-1胞膜外区2-30跨膜区2-31跨膜区31-32胞质区32-33胞质区33-57跨膜区34-57跨膜区58-65胞膜外区58-65胞膜外区66-88跨膜区66-88跨膜区89-143胞质区89-143胞质区144-162跨膜区144-162跨膜区163-172胞膜外区163-174胞膜外区173-192跨膜区175-192跨膜区193-204胞质区193-204胞质区205-219跨膜区205-219跨膜区220-252胞膜外区220-252胞膜外区253-278跨膜区253-279跨膜区279-285胞质区280-286胞质区286-311跨膜区287-311跨膜区312-368胞膜外区312-366胞膜外区 注:TMEM26:跨膜蛋白26;氨基酸残基顺序为N端-C端,位置是相对于膜的位置 Note:TMEM26:transmembrane protein 26;The sequence of amino acid residue was N-terminal to C-terminal,and the position was relative to cell membrane

2.2 TMEM26在视网膜中的表达

在人视网膜中，TMEM26主要在视网膜的外丛状层(outer plexiform layer,OPL)和IPL特异性表达，且不在细胞核内表达(图2)。在小鼠的视网膜切片中，Tmem26的表达情况与人视网膜的表达情况相似，主要表达在视网膜的OPL和IPL，且不在细胞核内表达(图3)。Isolectin B4染色结果显示，Tmem26不在血管细胞中表达(图4)。

图2 TMEM26在人视网膜中的表达 TMEM26阳性细胞呈绿色荧光(Alexa Fluor 488)，细胞核呈蓝色荧光(DAPI) A：TMEM26在视网膜的整体表达情况 主要在OPL和IPL表达(×400，标尺=50 μm) B：TMEM26在OPL的表达情况(×630，标尺=7.5 μm) C：TMEM26在IPL的表达情况(×630，标尺=7.5 μm) DAPI：4’,6-二脒基-2苯基吲哚；TMEM26：跨膜蛋白26；ONL：外核层；OPL：外丛状层；INL：内核层；IPL：内丛状层；GCL：神经节细胞层Figure 2 Expression of TMEM26 in human retina TMEM26-positive cells showed green fluorescence (Alexa Fluor 488),and nuclei presented blue fluorescence (DAPI) A:Distribution of TMEM26 in human retina TMEM26 was mainly expressed in OPL and IPL (×400,bar =50 μm) B:Expression of TMEM26 in OPL (×630,bar=7.5 μm) C:Expression of TMEM26 in IPL (×630,bar=7.5 μm) DAPI:4’,6-diamidino-2-phenylindole;TMEM26:transmembrane protein 26;ONL:outer nuclear layer;OPL:outer plexiform layer;INL:inner nuclear layer;IPL:inner plexiform layer;GCL:ganglion cell layer

图3 Tmem26在小鼠视网膜中的表达 Tmem26阳性细胞呈绿色荧光(Alexa Fluor 488)，细胞核呈蓝色荧光(DAPI) A：Tmem26在视网膜的整体表达情况 主要在OPL和IPL表达(×400，标尺=25 μm) B：Tmem26在OPL的表达情况(×630，标尺=7.5 μm) C：Tmem26在IPL的表达情况(×630，标尺=10 μm) DAPI：4’,6-二脒基-2苯基吲哚；Tmem26：跨膜蛋白26；ONL：外核层；OPL：外丛状层；INL：内核层；IPL：内丛状层；GCL：神经节细胞层Figure 3 Expression of Tmem26 in mouse retina Tmem26-positive cells showed green fluorescence (Alexa Fluor 488),and nuclei presented blue fluorescence (DAPI) A:Distribution of Tmem26 in mouse retina Tmem26 was mainly expressed in OPL and IPL (×400,bar=25 μm) B:Expression of Tmem26 in OPL (×630,bar=7.5 μm) C:Expression of Tmem26 in IPL (×630,bar=10 μm) DAPI:4’,6-diamidino-2-phenylindole;Tmem26:transmembrane protein 26;ONL:outer nuclear layer;OPL:outer plexiform layer;INL:inner nuclear layer;IPL:inner plexiform layer;GCL:ganglion cell layer

图4 小鼠视网膜Tmem26蛋白与血管定位关系(×200，标尺=25 μm) Tmem26阳性细胞呈绿色荧光(Alexa Fluor 488)，小鼠视网膜血管呈红色荧光(GS-IB4)，细胞核呈蓝色荧光 (DAPI),显示Tmem26在小鼠血管细胞中未见表达Figure 4 The co-location of Tmem26 protein and vessels in mouse retina (×200,bar=25 μm) Tmem26-positive cells showed green florescence (Alexa Fluor 488),and mouse retinal vessels were red fluorescence (GS-IB4),and nuclei presented blue fluorescence (DAPI).Tmem26 was not expressed in vessel cells of mouse

2.3 TMEM26基因的SNP分析与POAG关联情况

由于TMEM26蛋白在视网膜中的表达集中在IPL及OPL，比较特殊，为了探讨该基因是否与眼病有关，我们基于本课题组已发表的全基因组关联分析数据，探讨了

TMEM26

与POAG的关系。在1 007例具有高眼压特征的POAG患者样本与1 009例正常人样本的关联分析结果中，发现

TMEM26

区域的26个SNP位点，与POAG存在弱相关性(

P

<0.05)，其中10:63203054位点信号最强(

P

=0.001 7，

OR

=0.76)，提示该区域对POAG可能具有弱保护作用(表2)。

表2 10号染色体上TMEM26基因在1 007例POAG患者与1 009例正常人中的变异情况Table 2 Variation of TMEM26 gene in chromosome 10 among 1 007 POAG cases and 1 009 healthy controls SNPBPA1F_AF_UA2CHISQPORSEL95U9510:6317799163177991T0.197 90.231 6C6.7520.009 3630.818 50.077 130.703 70.952 110:6319240763192407A0.277 60.318 6AT8.0620.004 5200.821 70.069 200.717 50.941 110:6319241463192414TA0.282 60.322 1AA7.4120.006 4800.829 00.068 900.724 30.948 910:6320305463203054C0.130 80.166 0CA9.8450.001 7030.755 80.089 430.634 30.900 610:6320579163205791C0.199 40.233 1T6.7140.009 5680.819 40.076 930.704 70.952 810:6320616163206161G0.199 40.233 1C6.7140.009 5680.819 40.076 930.704 70.952 810:6320636163206361A0.199 40.233 1G6.7140.009 5680.819 40.076 930.704 70.952 810:6321609363216093T0.197 90.233 1A7.3440.006 7280.811 70.077 050.697 90.944 010:6322121463221214T0.073 20.097 4C7.5620.005 9630.731 20.114 200.584 60.914 610:6322176863221768T0.194 40.230 1C7.6490.005 6810.807 30.077 490.693 50.939 710:6323073863230738A0.196 90.231 6T7.1720.007 4060.813 40.077 210.699 10.946 210:6323203863232038T0.196 90.232 1C7.3720.006 6240.811 10.077 180.697 20.943 610:6323367163233671C0.259 50.299 2G7.8370.005 1180.820 90.070 550.714 90.942 610:6323694163236941T0.196 90.231 6G7.1720.007 4060.813 40.077 210.699 10.946 210:6324080463240804G0.196 90.231 1GA6.9740.008 2710.815 60.077 240.701 10.948 910:6324835863248358A0.196 90.231 1G6.9740.008 2710.815 60.077 240.701 10.948 910:6325700263257002C0.209 90.247 0T7.8210.005 1630.809 90.075 450.698 60.939 010:6325949563259495T0.209 90.247 0C7.8210.005 1630.809 90.075 450.698 60.939 010:6326487263264872C0.195 90.233 6T8.4460.003 6580.799 30.077 180.687 10.929 810:6326763063267630T0.207 40.244 5TA7.8910.004 9690.808 50.075 750.696 90.937 910:6327096963270969A0.207 40.244 0C7.6870.005 5630.810 70.075 770.698 80.940 510:6327194663271946AT0.206 90.244 0A7.9050.004 9310.808 20.075 810.696 60.937 710:6328004663280046C0.205 90.243 0G7.9330.004 8540.807 60.075 930.695 90.937 210:6328162763281627A0.200 40.238 6G8.5180.003 5160.799 90.076 570.688 40.929 410:6328684863286848C0.194 90.232 6A8.4780.003 5940.798 60.077 310.686 30.929 310:6328685963286859A0.196 40.233 1C8.0050.004 6650.804 00.077 170.691 20.935 3 注:TMEM26:跨膜蛋白26;POAG:原发性开角型青光眼;SNP:单核苷酸多态性;BP:碱基对位置(Hg19);A1:第一等位基因编码;F_A:病例等位基因频率;F_U:对照等位基因频率;A2:第二等位基因编码;CHISQ:非随机缺失的χ2检验;P:固定效应元分析P值;OR:固定效应评估值;SE:系数的标准差;L95:CMH检验优势比置信区间的下界;U95:CMH检验优势比置信区间的上界(数据来源于文献[11]原始数据集) Note:TMEM26:transmembrane protein 26;POAG:primary open-angle glaucoma;SNP:single nucleotide polymorphism;BP:base pairs (Hg19);A1:base of major allele;F_A:allele frequencies of affected patients;F_U:allele frequencies of healthy controls;A2:base of minor allele;CHISQ:χ2 test;P:P value of fixed effect meta-analysis;OR:assessed value of the fixed effects;SE:standard error of coefficient;L95:lower confidence interval for the odds ratio in Cochran-Mantel-Haenszel test;U95:upper confidence interval for the odds ratio in Cochran-Mantel-Haenszel test (Data were from the original data set of reference 11)

3 讨论

TMEM26是跨膜蛋白家族中的一员，亚细胞定位于细胞膜上，通过免疫组织化学染色观察到该蛋白在细胞质侧表达，不在细胞核内表达，其表达模式推测可能为突触，具有分泌神经递质的作用。膜蛋白对于物质转运、受体识别等具有重要意义，尤其是跨膜蛋白。多次跨膜的跨膜蛋白的跨膜结构通常可以形成物质转运通道；起连接作用的跨膜蛋白的亲水性结构域通常也具有调控作用，如通道开关和蛋白招募等，因此研究跨膜蛋白的跨膜结构对于理解和探讨跨膜蛋白的功能具有重要意义。人和小鼠TMEM26跨膜结构的比较可为动物实验部分的研究提供依据，并为最终结合到人的眼病提供参考。人和小鼠TMEM26蛋白结构的细微差别可能表示两者的调控作用以及对于物质的转运存在某些差别，但其具体意义仍需进一步研究。目前对

TMEM26

的研究相对较少，作为蛋白编码基因，最常见的转录本是由6个外显子构成的约6 kb的mRNA。除此之外，还有额外的转录本，如在小鼠中，

Tmem26

基因外显子2和外显子3之间还存在一段82 bp的外显子2a，插入外显子2a会导致移码突变，其最终结果是在外显子3中引入早期终止密码子，使得翻译提前终止，从而导致

Tmem26

表达异常。

蛋白结构对蛋白功能具有重要意义，如是否存在N-端信号肽和C-端结构域的数量等都将影响蛋白功能。TMEM26已被证实在Jurkat T细胞和乳腺癌细胞中是一种N-糖基化蛋白，这种N-糖基化修饰的TMEM26在质膜上的保留时间比非糖基化修饰的TMEM26更长，证明N-糖基化的TMEM26在质膜上具有重要功能。Hansel等通过Western blot在人乳腺癌细胞中检测出TMEM26的几种同工蛋白，主要包括含有368个氨基酸的非N-糖基化蛋白p40，以及主要的2种通过N-糖基化修饰形成的同工型蛋白p44和p53。由于蛋白结构复杂，预测的8次跨膜结构可能存在一定的误差，如Town等和Yuan等预测Tmem26蛋白偏向于7次跨膜。TMEM26具体的跨膜结构仍有待进一步研究。TMEM26是米色脂肪细胞的表面标志物，将白色脂肪组织褐变分化成米色脂肪组织是肥胖症十分有效的治疗手段，其可改善肥胖症患者葡萄糖和脂质代谢，及改善人类免疫缺陷病毒感染患者的心脏代谢健康,可用于检测促褐变药物的米色细胞的增量效果。通过GWAS分析发现，TMEM26与睡眠深度、紫杉烷对肺癌的治疗、抗精神病药氯氮平对精神分裂症的治疗、欧美人群儿童对食物过敏、二异氰酸酯哮喘发病机制和血压升高等方面均存在相关性。然而对TMEM26在视网膜中的功能研究较少。

位于RGC层的RGC与感光细胞之间有2层神经毡，即OPL和IPL，在OPL感光细胞与纵向的双极细胞连接，在IPL横向的水平细胞与神经节细胞连接。RGC通过树突与OPL和IPL的中间神经细胞形成突触，并连接到光感受器。感光细胞负责接受光刺激，将光信号传递给神经细胞，并由此经视神经传递给中枢神经，从而产生视觉影像。本研究结果显示，TMEM26在人和小鼠视网膜OPL和IPL中特异性表达。因此，进一步研究TMEM26的功能，特别是其对视网膜以及视觉方面的影响具有重要意义。

根据TMEM26在视网膜OPL和IPL中的特异表达情况，推测其表达模式主要为突触表达，可能具有分泌神经递质的作用，其分泌的神经递质可能会对RGC或视神经造成影响。基于结果显示TMEM26在IPL表达最高，且IPL厚度与POAG显著相关，推测该基因可能与POAG有关。检索本课题组已有数据发现TMEM26与POAG呈弱相关，但其突变具体的影响机制尚有待进一步研究。

综上所述，本研究结果显示，TMEM26在视网膜IPL和OPL表达，且在IPL表达最高，通过该基因的SNP和外显子测序结果均显示TMEM26与POAG呈弱相关。下一步我们将构建

Tmem26

敲除小鼠，从模式生物角度来研究该基因或蛋白的功能。

利益冲突

所有作者均声明不存在任何利益冲突

作者贡献声明

尹燚：参与选题与实验设计、实验操作、数据整理、统计分析、论文撰写及修改；冒瑶：实验操作、数据整理；杨正林：工作支持、实验指导；黄璐琳：参与选题与设计实验、实验指导、论文修改及定稿、经费支持