脂肪酸结合蛋白4在卵泡液局部的作用及其机制探讨
2022-05-10
(青岛大学附属医院生殖医学科，山东 青岛 266003)
脂肪酸结合蛋白4(FABP4)是一种小分子脂质结合蛋白，主要在脂肪细胞、巨噬细胞中表达并分泌[1-2]；其功能是可逆地结合脂质并将其运输到细胞中特定的细胞器，如线粒体、过氧化物酶体、细胞核和内质网[3]，进而参与调控脂质代谢、炎症反应、自身免疫反应和氧化应激过程[4-6]。卵泡液在卵泡发育至成熟窦卵泡的过程中逐渐积聚，由免疫细胞、细胞因子、活性氧、脂质、激素等多种物质组成[7]。目前研究认为，卵泡液中炎症因子以及活性氧自由基(ROS)参与不同阶段的卵泡发育、卵母细胞成熟过程[7-9]。FABP4作为炎症、氧化应激和脂代谢共同递质，目前在女性生殖领域的研究主要集中在胚胎着床过程，而FABP4是否参与卵泡液局部炎症反应及脂质代谢过程，尚缺乏相关临床证据。因此本研究旨在探讨FABP4在卵泡液局部环境中主要参与的生理过程，及其对卵母细胞质量的影响。
1 对象与方法
1.1 研究对象
本研究纳入2020年6月—2021年1月在青岛大学附属医院生殖医学科因单纯输卵管和(或)男性因素行体外受精/卵胞质内单精子注射-胚胎移植(IVF/ICSI-ET)的女性。排除标准：①存在月经周期紊乱和(或)性激素测定异常；②存在甲状腺疾病、肾上腺疾病、多囊卵巢综合征、子宫内膜异位症；③有恶性肿瘤病史。根据受试者卵泡液中FABP4浓度的百分位数分为3个浓度组：A组(FABP4的浓度≤24.56 μg/L，P0～P25)，B组(24.56 μg/L
1.2 IVF/ICSI及胚胎培养
所有受试者均采用拮抗剂方案进行促排卵，待双侧卵巢至少2个优势卵泡的直径≥18 mm或者3个≥17 mm时，结合雌二醇(E2)水平确定扳机时间，当晚肌注人绒毛膜促性腺激素(hCG)(丽珠医药集团股份有限公司)6 000～8 000 U，36～38 h后在阴道超声引导下穿刺取卵。取卵后4～6 h，根据精液参数或既往受精情况采用常规IVF/ICSI授精。体外受精后，在37 ℃、含体积分数0.06 CO2培养箱中使用G-1medium培养胚胎，18 h后观察受精情况，72 h后评估胚胎质量：根据形态学参数将早期胚胎分为4级，Ⅰ、Ⅱ级胚胎为优质胚胎[10]。
1.3 观察指标的收集和卵泡液指标检测
受试者一般观察指标，包括年龄、体质量指数(BMI)、胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)、基础E2、基础孕酮(P)、基础窦卵泡数(AFC)；促排卵监测指标，包括促性腺激素(Gn)使用总量、hCG注射日E2、hCG注射日P；IVF实验室指标，包括获卵数、优质胚胎率；卵泡液观察指标，包括总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、三酰甘油(TG)、FABP4、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、白细胞介素-6(IL-6)和氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)。其中优质胚胎率=受精后72 h优质胚胎数/2PN胚胎总数×100%。
卵泡液收集和检测：取卵过程中，第一穿刺卵泡选择直径18～22 mm者进行穿刺，并收集第一管无血液污染的卵泡液，采用常温离心法(1 800 r/min离心8 min)去除细胞沉淀和杂质，留取上清液分装后于-80 ℃低温保存待测。采用日立化成诊断系统株式会社提供的LDL-C(选择性可溶化法)、TC(酶法)和TG(去游离法和酶法)检测试剂盒，分别检测卵泡液中LDL-C、TC和TG的浓度，检测仪器为贝克曼库尔特AU5821全自动生化分析仪(克曼库尔特有限公司,美国)，每份样品均设复孔检测。采用武汉伊莱瑞特生物有限公司提供的酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒分别检测卵泡液中FABP4、MCP-1、IL-6和ox-LDL的浓度，检测仪器为TECAN SUNRISE酶标仪(帝肯公司，瑞士)，每份样品均设复孔检测。
1.4 统计学方法
2 结 果
2.1 3组受试者基线数据和实验室观察指标比较
本研究共纳入符合要求的受试者为122例，其中A组30例，B组62例，C组30例。3组受试者的基线数据，包括年龄、BMI、基础性激素(E2、P)、hCG注射日性激素(E2、P)、HOMA-IR、AFC和Gn使用总量比较，差异无显著性(P>0.05)；3组受试者实验室观察指标(获卵数和优质胚胎率)比较，差异无显著性(P>0.05)。见表1。
2.2 3组受试者卵泡液中相关因子浓度的比较
A、B和C组卵泡液中MCP-1、IL-6、ox-LDL水平随FABP4浓度增高而增高，组间比较差异有显著性(H=11.371～54.114，P<0.01)；两两比较结果显示，A组MCP-1、ox-LDL水平均显著低于B、C组(H=-65.017～-19.447，P<0.01)；A组IL-6水平显著低于C组(H=-30.633，P<0.01)；并且B组MCP-1、ox-LDL水平均显著低于C组(H=-36.337、-44.331，P<0.01)；3组受试者卵泡液中LDL-C、TC和TG水平比较差异均无显著性(P>0.05)。见表2。
表1 3组受试者基线数据和实验室观察指标比较Tab.1 Comparison of baseline data and laboratory markers between the three groups
表2 3组受试者卵泡液各因子浓度的比较Tab.2 Comparison of the concentrations of various factors in follicular fluid between the three groups
2.3 影响优质胚胎率的多因素线性回归分析
将年龄、BMI、AFC、Gn使用总量、hCG注射日E2、hCG注射日P及卵泡液中FABP4、MCP-1、IL-6、ox-LDL、LDL-C、TC、TG共13个自变量纳入线性回归模型，采用后退法筛选自变量。结果显示，模型中剩余5个自变量，其中卵泡液中FABP4(β=-0.520，95%CI=-0.981～-0.059,P<0.05)，IL-6(β=-0.114，95%CI=-0.212～-0.015,P<0.05)，Gn使用总量(β=-0.008，95%CI=-0.016～-0.001,P<0.05)是优质胚胎率的独立危险因素，而卵泡液中ox-LDL(β=0.010，95%CI=0.003～0.017,P<0.05)，BMI(β=2.122，95%CI=0.390～3.853,P<0.05)是优质胚胎率的独立保护因素，5个自变量的方差膨胀因子都小于2，不存在共线性。
3 讨 论
研究表明，FABP4是炎症、脂代谢和氧化应激相关信号通路中共同的调节因子，在多种代谢性和炎症性疾病中起关键作用[11-13]。MCP-1主要由内皮细胞、成纤维细胞和免疫细胞表达，参与单核细胞/巨噬细胞迁移和渗透[14]。IL-6主要由免疫细胞产生，在卵泡发育过程中影响血管通透性以及血管生成[7]。本研究表明，卵泡液中MCP-1和IL-6水平随FABP4浓度的升高而增高，提示FABP4在卵泡液环境中参与局部炎症过程。在巨噬细胞和脂肪细胞中沉默FABP4可导致MCP-1、IL-6、TNF-α等炎症因子显著减少[11,15]。目前研究认为FABP4会通过激活IKK-NF-κB以及JNK-AP-1通路促进炎症发生[16-17]。卵泡液中炎症因子参与卵巢正常生理过程，包括排卵期的血管生成、类固醇生成、卵母细胞成熟、白细胞浸润以及卵泡破裂和重塑[18]。因此或许可以认为卵泡液中FABP4可能通过调节炎症反应参与卵巢正常的生理过程，但还需要进一步研究证实。
ox-LDL是LDL受ROS氧化修饰后的产物，当机体发生ROS和抗氧化系统失衡，过多的ROS会引起脂质过氧化，其中包括LDL，因此ox-LDL可以作为体内氧化应激的标记物[19]。本研究表明，ox-LDL浓度随FABP4的升高而增高，提示FABP4与卵泡液局部氧化应激可能有关。既往研究表明，FABP4与氧化应激之间存在相互作用，ox-LDL可在多种细胞类型中诱导FABP4表达[17,20]，而在子宫内膜基质细胞和巨噬细胞中，沉默FABP4可降低其氧化应激水平[6,21]。此外，FABP4-/-小鼠体内由ox-LDL诱导产生的MCP-1以及TNF-α表达明显减少[22]。因此或许可以认为卵泡液中FABP4可能与局部氧化应激有关系，并且ox-LDL可能是部分通过FABP4上调炎症水平，但具体机制仍需要进一步研究。
FABP4除了是炎症过程重要的递质，同时还可调控脂质代谢过程；FABP4可逆性结合脂肪酸并完成其亚细胞器的靶向运输，脂肪酸随即转化并合成TG和TC；TG是大多数生物体重要的能量储存形式，对卵母细胞和卵巢的发育至关重要；TC是所有类固醇激素的前体，进一步通过酶促反应逐步合成P、睾酮和E2等类固醇激素[8]。FAN等[8]在鹅卵巢颗粒细胞的体外实验表明，FABP4过表达的颗粒细胞中细胞色素P45011A1(CYP11A1)和细胞色素P45019A1(CYP19A1)mRNA和蛋白水平明显增高，培养基中P和E2浓度明显升高，提示FABP4促进类固醇激素合成。临床试验也表明，循环血中FABP4与雄激素水平独立相关[13]。但本研究未观察到基础或hCG注射日雌孕激素水平以及卵泡液中TG和TC浓度在不同FABP4浓度分组间的差异。此外，既往研究表明循环血液中FABP4水平的升高与BMI及胰岛素抵抗增高、血脂代谢紊乱有关[23]，但本研究中也未观察到卵泡液中FABP4与HOMA-IR、BMI的关联性。这种卵泡液中FABP4和循环血液中FABP4的差异可能与卵泡液特殊炎症环境有关。研究表明卵泡液中MCP-1、IL-6、IL-8、IL-10等炎症因子水平均高于循环血液中[24]。因此，推测卵泡液中FABP4受局部炎症环境影响更大，进而可能掩盖了FABP4在卵巢局部脂代谢和类固醇合成过程中的作用。
优质胚胎率是体现卵母细胞质量的重要IVF实验室指标，与女性生育力密切相关。生理状态下，卵泡发育和卵母细胞成熟受到炎症因子和ROS的调控；而各种病理情况下，过度激活的炎症反应和氧化应激对女性生育力产生负面影响，但临床研究结果尚存在争议[7,9,25]。本研究线性回归模型表明，卵泡液中FABP4是优质胚胎率的危险因素，且该作用独立于卵泡液中IL-6、ox-LDL及BMI和Gn使用总量。目前FABP4对卵母细胞质量影响的直接机制研究较少，根据本研究的结果可以推测，卵泡液中FABP4对卵母细胞质量的不利影响可能不限于其与炎症因子IL-6以及ox-LDL的关联，FABP4在脂代谢和炎症反应中作用的具体机制仍有待进一步实验研究。
综上所述，本研究结果显示，卵泡液中FABP4可能是通过与MCP-1、IL-6和ox-LDL的相互作用参与了局部的炎症反应和氧化应激过程，并且进一步影响卵母细胞质量。此外，本研究并没有观察到卵泡液中FABP4与BMI、HOMA-IR和卵泡液中脂代谢指标(TC、TG和LDL-C)存在显著的临床关联，而这可能与卵泡液局部独特的促炎环境有关。但本研究样本量有限，结论尚需要多中心研究进一步证实。
利益冲突声明：所有作者、资助者、作者单位不存在与公众/个人产生研究客观性、公正性、经济利益等方面的利益冲突。
ConflictsofInterest： All authors, sponsors and Author affiliation disclose no relevant conflicts with the public or individuals in the objectivity, fairness, or financial interest of the research.
伦理批准和知情同意：本研究涉及的所有试验均已通过青岛大学附属医院医学伦理委员会的审核批准(文件号QYFYWZLL26587)。受试对象或其亲属已经签署知情同意书。
EthicsApprovalandPatientConsent： All clinical experimental protocols in this study were reviewed and approved by The Medical Ethics Committee of The Affiliated Hospital of Qingdao University(Approval Letter No. QYFYWZLL26587). Consent letters have been signed by the research participants or their relatives.
作者贡献：刘建新、夏晨参与了临床试验设计；夏晨、刘姝含、耿颖春、汤秀明、王琳、刘建娥参与了论文的写作和修改。所有作者均阅读并同意发表该论文。
Contributions： The study was designed byLIUJianxinandXIAChen. The manuscript was drafted and revised byXIAChen,LIUShuhan,GENGYinchun,TANGXiuming,WANGLin, andLIUJian′e. All the authors have read the last version of the paper and consented submission.
