汞离子荧光生物传感器的构筑及性能表征*

韦柳丹，郑亚楠，王 丹

(南宁师范大学 化学与材料学院，广西 南宁 530001)

0 引言

汞已被广泛应用于汽车制造、炼油、电力、能源电池等多个行业[1-4]。工业大生产导致大量汞随工业废水排放到自然环境中，排放的汞污染随着生物链极易进入人体，并在人体内不断累积，导致严重的脑损伤和肾脏疾病[5-8]。为了有效防御汞污染的暴露对人类的危害，开发经济、实用、实时的汞污染现场检测技术极为重要。目前，检测汞离子的常用技术手段有原子吸收光谱法(AAS)、原子荧光光谱法(AFS)、电感耦合等离子体原子发射光谱法(ICP-AES)等[9-12]。这些方法具有良好的灵敏度和选择性，但是在使用这些检测方法时也存在很多局限性。比如，仪器维护成本高、预处理复杂、工作环境要求高、依赖专业的操作人员等缺点，极大地限制了它们作为野外便携式设备用于自然环境中汞污染的简单和快速分析。

荧光光谱分析法是检测重金属的有力工具。迄今为止，已经开发了大量的荧光探针用于检测金属离子，包括纳米粒子、生物分子、化学小分子和高分子聚合物等[13-16]。其中，荧光蛋白可利用其固有的或者构建的金属离子结合特性，有效地检测金属离子[17-22]。此外，由于可遗传编码的特性，荧光蛋白在追踪活细胞内的金属动力学方面具有独特的优势[23]。然而，由于制备和保存的困难，它们在实践中几乎没有应用于金属污染的检测。因此，值得尝试去克服这些限制，将荧光蛋白应用于工业废水中重金属离子的现场可视化检测。

本项研究成功设计了能够响应Hg2+信号的荧光蛋白突变体 (mCherry L199C)。如图1，变体蛋白mCherry L199C是通过在荧光蛋白发射团附近引入一个半胱氨酸，Hg2+与半胱氨酸残基的结合会改变发色团周围环境的对称性，进而促使荧光发生猝灭。经性能测试分析发现，随着Hg2+浓度的增加该荧光生物传感器的荧光强度不断降低，而在加入Hg2+的螯合剂EDTA以后，其荧光强度又可以很大程度的恢复。其次，该荧光生物传感器对目标金属离子Hg2+的响应程度远高于其它金属离子，并且在干扰离子存在的情况下其对Hg2+的响应程度基本不受影响。基于该荧光生物传感器良好的响应性能，利用蛋白质固定化技术开发了一种蛋白-琼脂糖凝胶试纸，实现了水环境中汞污染的简单、便捷和快速的可视化检测。

图1 荧光蛋白mCherry发色团的周围环境及突变体L199C的响应机理

1 实验部分

1.1 主要试剂和仪器

本试验所用的酶购自宝日医生物技术(北京)有限公司，所涉及到的引物合成及测序均由上海生工生物工程有限公司完成，所有化学试剂均购自上海阿拉丁生化科技有限公司，配制缓冲液的试剂除特殊说明均为国产分析纯试剂。所使用仪器主要包括荧光分光光度计(日本岛津，RF-6000)、紫外分光光度计(日本岛津，UV-3600PLUS)、圆二色光谱仪(英国应用光物理，Chirascan)和紫外暗室分析仪(上海宝山谷村电光仪器厂，ZF-20D)。

1.2 实验方法

1.2.1 荧光生物传感器表达载体的构建

通过分子克隆和定点突变技术把mCherry及突变体mCherryL199C的基因片段克隆至质粒pET28α中，获得mCherry及突变体mCherryL199C的表达载体。具体流程如下：首先利用PCR技术从模板质粒上大量扩增mCherry基因片段；接着，利用限制性内切酶NdeI和XhoI对载体质粒pET28α和目的基因mCherry片段分别进行双酶切，从而使它们各自带有相同的粘性末端；最后，使用T4 DNA连接酶将载体质粒pET28α和目的基因片段mCherry连接，实现mCherry-pET28α表达载体的构建。构建的载体经PCR初步鉴定成功后送至上海生工生物工程有限公司进行测序鉴定，以确保基因序列完全正确。以mCherry-pET28α重组质粒为模板，使用 PCR定点突变技术，获得突变体mCherryL199C-pET28α的表达载体。将这些表达载体通过化学法分别转化至大肠杆菌BL21(DE3)表达菌株中，用于后续的诱导表达实验。

1.2.2 荧光生物传感器的体内表征实验

将构建好的表达菌株mCherry-pET28α(对照组)和mCherryL199C-pET28α(实验组)分别接种至含30 μg/mL卡那霉素的LB培养基中，在温度为37℃转速为250 r/min的条件下过夜培养。过夜培养的菌液和培养基按1∶100的比例进行扩大培养，直至菌液的浊度值OD600=0.5～0.6时，加入终浓度0.5 mM的IPTG在16°C进行诱导表达12 h。将表达目的蛋白的菌液浊度值调至OD600=1后，按8 mL/管进行分装并通过高速离心的方式进行收集。菌饼用10 mM的PBS缓冲液洗涤两次后，使用1 mL的10 mM的PBS缓冲液重悬。向重悬的菌液中加入不同浓度的Hg2+后，在室温避光条件下在摇床上孵育1.5 h，之后使用荧光分光光度计测定荧光值。本实验对照组和实验组各平行做四组，结果取四组数据的平均值。

1.2.3 荧光生物传感器的表达及纯化

将构建好的表达载体mCherryL199C-pET28α按1.2.2步骤中所述的方式进行诱导表达12 h后，通过高速离心的方式进行收集。菌饼使用10 mM的PBS缓冲液重悬洗涤两次，再经10 mL 超声裂解液(10 mM Tris-HCl，200 mM NaCl，25 mM咪唑，5% 甘油)重悬后超声30 min(超3 s，停5 s，功率为25%)。超声破碎的细胞离心后获得上清溶液，并使用0.22 μm的滤膜进行过滤。把含有目的蛋白的上清溶液置Ni-NTA金属螯合层析柱上，利用亲和层析法对目的蛋白进行纯化。目的蛋白最终在不断提高咪唑浓度(75～200 mM)的缓冲液中进行线性洗脱，最终获得含有His-标签的目的蛋白mCherry L199C。目的蛋白经蛋白酶HRV3C过夜低温酶切后去除标签，最终获得不带标签的mCherry L199C，用于后续的性能表征实验。

1.2.4 汞离子荧光生物传感器的性能测试实验

为了测定荧光蛋白生物传感器对Hg2+响应的灵敏度，将不同浓度的Hg2+(0～10 μM)加入到纯化后的蛋白溶液中，室温避光条件下放置摇床上孵育0.5 h后，用荧光分光光度计测定蛋白样品的荧光强度。近一步，向加入Hg2+以后荧光强度发生变化的蛋白质样品中，再添加不同浓度的金属螯合剂EDTA孵育0.5 h后测荧光，观察荧光是否能够恢复。

为了测定荧光蛋白生物传感器对Hg2+响应的特异性，分别将8种金属离子(Cr3+，Cd2+，Pb2+，Ni2+，Cu2+，Zn2+，Ag+和Fe3+)添加到纯化后的蛋白溶液中，用上述同样的方式处理后测定样品荧光值。为了测定荧光蛋白生物传感器识别Hg2 +的抗干扰性能。将1 μM Hg2+和5 μM其他金属离子(Cr3+，Cd2+，Pb2+，Ni2+，Cu2+，Zn2+，Ag+和Fe3+)的混合物分别添加到蛋白溶液中，用上述同样的方式处理后测定样品荧光值。

为了研究Hg2+对传感器二级结构及发色团环境的影响，将不同浓度的Hg2+(0～3.33 μM)添加到蛋白溶液中，室温黑暗条件下放置摇床孵育0.5 h，分别使用紫外可见分光光度计和圆二色光谱仪(CD)测定其吸收光谱。

1.2.5 蛋白-琼脂糖凝胶试纸的制备及对Hg2+的检测

为了实现对Hg2+的简单、便捷和快速的可视化检测，我们利用热可逆的凝胶琼脂糖凝胶封装荧光蛋白制备了蛋白-琼脂糖凝胶试纸，并使用智能手机的内置摄像头与紫外暗箱灯开发了在线检测Hg2+浓度的便携式设备。具体制备过程为：将加热熔化的琼脂糖溶液(0.75%)逐渐冷却至37℃，然后与荧光蛋白溶液按体积比为5∶3的比例均匀混合。取450 μL混合液放在模具中冷却定型，并将定型后的凝胶固定在试纸条上。滴加30 μL不同浓度Hg2+溶液在凝胶中心。然后将放置凝胶试纸条放入紫外暗室分析仪，在室温下孵育5 min后，利用1600万像素的智能手机在365 nm紫外光照射下拍摄。最后，使用ImageJ软件对捕获图片中每个凝胶小球的亮度进行量化，计算出强度值用作数据分析。

2 实验结果与讨论

2.1 荧光生物传感器的体内表征实验

体内实验研究结果表明(图2)，在0～100 μM Hg2+浓度范围内，mCherry的荧光值几乎没有任何变化。但是，所设计的荧光生物传感器mCherry L199C在浓度为10 μM Hg2+的存在下，荧光发生明显的下降。继续增加Hg2+浓度至100 μM后，所设计的传感器mCherry L199C荧光几乎完全淬灭。由此可知，通过分子设计改构的荧光蛋白突变体mCherry L199C可响应Hg2+的信号。

图2 对照组mCherry和实验组mCherry L199C对Hg2+响应

2.2 荧光生物传感器响应灵敏度及可逆性响应能力

为了便于分析，将测定的荧光值运用ΔF/ΔFmax值拟合，绘制荧光猝灭曲线(图3)。如图所示，在0～10 μM Hg2+浓度范围内，随着Hg2+浓度的增加，体系荧光值不断下降，在Hg2+浓度达到10 μM的溶液中，约99%的荧光被猝灭且淬灭非常迅速，在约0.5 min内能够达到平稳。并且传感器的荧光在完全猝灭情况下，随着金属螯合剂EDTA浓度的不断增加，其荧光也得到逐渐的恢复，能恢复到其原始荧光的80%。综上表明，本设计的荧光生物传感器可快速的响应Hg2+的信号，并且Hg2+与该传感器的结合具有可逆性，在一定浓度的强络合物条件下其荧光可很大程度的恢复。

图3 荧光生物传感器的猝灭曲线及荧光恢复柱状图

2.3 荧光生物传感器的选择性及抗干扰能力

从实验结果可以看出(图4)，浓度为5 μM的金属离子(Cr3+，Ni2+，Pb2+，Cd2+，Cu2+，Zn2+，Ag+和Fe3+)对传感器的荧光几乎没有影响。而向上述溶液添加浓度为5 μM Hg2+后，传感器的荧光猝灭程度达到98%，猝灭程度与单独加入Hg2+的溶液相比并没有太大的差异。结果表明，在Hg2+与其他金属混合的条件下，蛋白对汞离子的识别不会受到其他金属离子影响,证实了该传感器对目标金属离子Hg2+具有良好的选择性，并且在有其它金属离子存在时，其对Hg2+的特异性响应不受影响，具有较强的抗干扰能力。

图4 荧光生物传感器对单一金属和混合金属的选择性测定

2.4 荧光生物传感器的响应机理研究

图5 荧光生物传感器的圆二色光谱和紫外光谱表征

紫外-可见光谱分析表明，加入Hg2+，荧光生物传感器mCherry L199C去质子化发色团在波长584 nm处的出现峰值吸收下降。当在1 μM传感器溶液中添加终浓度3.33 μM Hg2+后，在584 nm处的吸光度降低了5倍。同时，在质子化发色团在450 nm处的吸光度随着Hg2+浓度的提高不断上升，并且在500 nm波长处达到等值吸收。与紫外吸收光谱对应，该传感器圆二色光谱的近紫外范围内也出现两个相应的负峰。以上实验现象表明，Hg2+与传感器发色团周围199位引入的半胱氨酸残基配位后，将改变发色团环境的对称性,破坏发色团激发过程中的质子转移过程，从而使质子化的发色团比例下降，进而促使荧光发生猝灭。

2.5 蛋白-琼脂糖凝胶试纸对Hg2+的检测

通过对蛋白-琼脂糖凝胶试纸的分析(图6)，可以发现试纸的荧光强度随着Hg2+浓度的增加而降低。当Hg2+浓度达到10 μM时，蛋白的荧光立即被淬灭。用Image J分析可知，荧光强度随着Hg2+的增加在0～10 μM的浓度范围内线性减小，数据显示出良好的线性相关性(R2= 0.996)(数据点代表至少3个独立平行实验的平均值)。当滴加浓度为10 μM其他金属离子时，试纸的荧光强度与滴加Hg2+的形成较大反差，未发生明显变化。由此证明了蛋白-琼脂糖凝胶试纸可以作为高通量筛选工具用于初步检测自然界中汞污染的存在，通过这种策略可以实现对Hg2+的现场快速可视化检测。

图6 蛋白-琼脂糖凝胶试纸检测性能测试结果图

3 结论

本研究成功利用蛋白质工程技术，在粉红色荧光蛋白mCherry的发色团附近引入易于Hg2+配位的半胱氨酸残基，通过Hg2+与半胱氨酸残基结合后对发色团环境的改变，设计出荧光猝灭型的生物传感器。该传感器可以快速可逆的响应微摩尔浓度的Hg2+信号，并且对Hg2+的响应具有良好特异性和抗干扰能力。此外，利用蛋白质固定化技术制备的凝胶试纸，不但操作过程简单、成本廉价、所需时间较短，还可以实现汞污染的现场可视化检测，有应用价值。