纳米Te的生物合成及其抗菌、催化性能的研究*

万光仪，孙维良，武 超

(1. 安徽大学 物质科学与信息技术研究院， 合肥 230601；2. 安徽大学 资源与环境工程学院， 合肥 230601)

0 引 言

碲以及其化合物在冶金、玻璃生产、制药、橡胶硫化、电子工业等各个领域都有广泛应用[1-2]。而碲纳米颗粒(Te NPs)具有更大比表面积、高压电性、高热电性能、高光电导性和非线性光学特性等独特特性，引起了世界各国研究者的关注[3-5]。

传统纳米碲的合成方法主要有物理法、化学法，物理法所需设备昂贵以及能耗高，化学法常常伴随着有毒或危险化学品的使用[6](如水合肼、酚类、有机醇)。而利用微生物合成的纳米颗粒有简单、廉价、结构可控制和友好等优点[7]。这使研究人员筛选出清洁、无毒、环保的合成纳米碲的生物资源。Amoozegar等[8]从含盐环境样品中分离中度嗜盐菌Salinicoccussp.QW6、B Zihayatd[9]在温泉中分离的Pseudomonaspseudoalcaligenes均可合成Te NPs。

由于纳米颗粒巨大的比表面积，具有超强的活性及更强的组织渗透性，其杀菌作用是普通材料的数百倍[10]。范月圆等利用多粘类芽孢杆菌制备纳米银及其抑菌活性的研究[11]，Tran和Webster对硒纳米材料抗菌潜力的研究[12]。

本研究利用皮特不动杆菌(Acinetobacterpittii)还原Te(Ⅳ)，并通过一系列物理化学表征证明该菌株合成了Te纳米棒(Te NRs)。并利用Te NRs进行了抗菌性能[16]的研究以及其催化PMS降解RhB的性能的研究，为Te NRs在水污染治理方面提供了新的方向。

1 实 验

1.1 材 料

1.1.1 菌 种

皮特不动杆菌(Acinetobacterpittii)，革兰氏阴性菌(Escherichiacoli)和革兰氏阳性菌(Bacillussubtilis)

1.1.2 试剂

亚碲酸钠(Na2TeO3)、过一硫酸氢钾复合盐(PMS)、C5H10NaS2·3H2O(DDTC)、Tris-HCl(pH=7.0)，罗丹明B，所有试剂均为分析纯。

1.1.3 培养基

LB培养基：Trypone 10 g/L，Yeast extract 5 g/L，NaCl 10 g/L。需要固体培养基时，加入琼脂 18.0 g/L。

矿物盐培养基：NaCl 0.46 g/L，(NH4)2SO40.255 g/L，MgSO4·7H2O 0.024 g/L，K2HPO40.225 g/L，KH2PO40.225 g/L，Hepes 4.766 g/L，微量元素5 mL/L；pH=7.0。

1.2 方法

1.2.1 细菌培养以及Te(Ⅳ)的还原

将Acinetobacterpittii接种到50 mL LB培养基，在30 ℃、150 r/min的恒温培养箱中培养24 h；然后在6 000 r/min，5 min条件下离心收菌，用矿物盐培养基清洗3次后，重悬，将初始浓度OD600=1.0的菌液接种至矿物盐培养基中。同时加入40 mmol/L 果糖和终浓度为0.1 mmol/L的Na2TeO3，在37 ℃、150 r/min的摇床中避光培养还原Te(Ⅳ)。在探究Te(Ⅳ) 还原时的影响因素时，除因素条件外，其他反应条件保持不变。

1.2.2 Te(Ⅳ)测定方法

溶液中亚碲酸盐的测定方法采用文献[17]中描述的 DDTC方法：取1 mL培养液在9 700 g下离心10 min，依次加入0.5 mol/L Tris-HCl(pH=7.0)溶液3 mL和10 mmol/L DDTC溶液1 mL，混匀，室温避光反应10 min后测定OD340 nm。

1.2.3 Te NRs的表征

使用TEM透射电子显微镜在加速电压为200 kV的条件下获得了Acinetobacterpittii合成Te NPS的照片。使用配备了EDX(能量色散X射线)微分析仪的SEM(PhilipsXL30，16 kV)装置观察Acinetobacterpittii的表面特征以及分析生物合成的Te NRs样品的表面和元素组成，并通过聚焦在Te NRs的簇上记录了EDS光谱。采用紫外-可见分光度计(型号Vertex80+Hyperion 2000)在200～800 nm 的波长范围内记录纯化的Te NRs的紫外-可见光谱。利用 X射线衍射仪(型号为*STADIVARI)，在0.1541 nm的CuKa辐射下、2θ=10°～90°，对生物合成Te NRs的晶体结构进行了分析。

1.2.4 Te NRs的纯化

为了获得Te NRs，在9 700 g下离心10 min收集含有Te NRs的培养物，沉淀用PBS洗涤3次，再重新悬浮于无菌去离子水中，放入冷冻研磨仪中研磨(60 Hz，24 min)。细胞破碎后，将悬浮液以3 500 g离心10 min，保留上清液，弃去含有细胞碎片的沉淀。将获得的黑色胶体悬浮液透析过夜，最后用0.22 μm滤头过滤，得到Te NRs溶液。

1.2.5 Te NRs的抗菌性能

纯化后的Te NRs使用电感耦合等离子质谱仪(ICP-MS)定量。利用不同浓度Te NRs(6，12，24，48 mg/L)对革兰氏阳性细菌(Bacillussubtilis)和革兰氏阴性细菌(E.coli)进行了抑菌圈实验，并用24 mg/L Te NRs对以上两种细菌处理2.5 h，使用扫描电子显微镜(SEM)观察细菌的形态学变化，研究Te NRs的抗菌性能。

1.2.6 Te NRs催化PMS氧化降解RhB

向25 mL锥形瓶中加入20 mg/L的RhB溶液， 再加入0.06 g/L Te NRs 和0.04 g/L PMS。在150 r/min、35 ℃恒温水浴振荡，每隔0.5 h取出样品，用0.45 μm滤头过滤，并立即用分光光度计在λmax=554 nm处测定吸光度，实验设置3组平行样。

2 结果与分析

2.1 菌株合成Te NRs

菌株Acinetobacterpittii在含0.5 mmol/L Te(Ⅳ)和不含Te(Ⅳ)的平板和还原培养基中好氧培养48 h后，结果如图1所示。 在无Te(Ⅳ)的情况下平板(图 1(a))和培养基(图 1(c))无黑色物质产生；而添加 Te(Ⅳ)的平板(图 1(b))和培养基(图 1(d))的颜色会变黑。此外，在非生物对照中Te(Ⅳ)并未发生任何变化，证实了黑色元素Te是Te(Ⅳ)还原的产物。这种现象以前也有[18-19]报道，黑色是Te(0)累积的结果。

图1 Acinetobacter pittii在含 0.5 mmol/L Te(Ⅳ)(a,c)或不含 Te(Ⅳ)(b,d)的琼脂平板和矿物盐培养基上培养 48 h 后 的生长情况Fig 1 Growth of Acinetobacter Pittii cultured for 48 h on agar plate and mineral salt medium containing 0.5 mmol/L Te(Ⅳ) or without Te(Ⅳ)

2.2 合成Te NRs的影响因素

图2显示，Acinetobacterpittii合成Te NRs的最佳Na2TeO3浓度和pH分别为0.1 mmol/L和8(图2a，b)。当初始Na2TeO3浓度为0.5 mmol/L，Acinetobacterpittii对Te(Ⅳ)的还原量最高(约0.42 mmol/L)。当初始Te(Ⅳ)浓度继续升高至1 mmol/L，Te(Ⅳ)还原率急剧下降，这是由于Te(Ⅳ)的毒性导致细菌活性的下降。Acinetobacterpittii可以在较大的pH范围内还原Te(Ⅳ)，pH值为7.0～9.0时，Te(Ⅳ)的还原率都超过80%，但是当pH下降6.0时，Te(Ⅳ)还原速率明显降低，推测在酸性环境下菌生长受到抑制，导致其还原能力的降低。

图2 不同初始Te(Ⅳ)浓度(a)以及不同pH条件(b)下Te(Ⅳ)的还原率(b)Fig 2 Reduction rate of Te(Ⅳ) under different initial Te(Ⅳ) concentrations and different pH conditions

2.3 Te NRs的表征

扫描电镜(SEM)分析表明，Acinetobacterpittii为短棒状，(长度为1.7～2.6 μm，直径为0.7～0.9 μm)(图3(a))。透射电镜(TEM)分析表明，Te NRs形态主要为棒状结构，直径在50～100 nm之间(图3(b))，同时成功纯化出Te NRs(图3(c))。对Te NRs的EDS分析清楚地揭示元素碲在3.72 keV处的显著峰，Cu产生的峰值是由于Te NRs滴于铜网上造成(图3(d))。

图3 Acinetobacter Pettii合成Te NRs的扫描电子显微镜图(a)、透射电子显微镜图(b)，纯化后Te NRs的透射电子显微镜图(c)，Te NRs的能谱图(d)Fig 3 SEM and TEM of the synthesis of Te NRs by Acinetobacter Pittii, TEM of purified Te-NRs, and EDS spectrum of Te NRs

图4(a)是制备的Te NRs的紫外可见光谱,发现在210 nm处的有明显的吸收峰。已有文献证实Te NRs的特征峰是由于表面等离子共振(SPR)[20]，证明Te NPs的存在。图4(b)给出Te NRs的X射线衍射谱，XRD 图谱通过和标准物质的卡片比对后，发现符合Te的标准卡(ICDD卡号36-1452)，特征峰值出现在27.56°、28.26°、40.44°、43.33°和 49.62°分别对应于Te纳米晶体的晶面(101)、(102)、(110)、(111)和(201)，这证明得到的Te NRs以晶体的形式存在[21]。由XPS(图3(c))可知Te元素的峰由Te3d3/2和Te3d5/2两个峰组成，其结合能分别为583.1和573.1 eV，根据标准图谱对比可知Te为0价。由XPS(图4(c))可知Te元素的峰由Te3d3/2和Te3d5/2两个峰组成，其结合能分别为583.1和573.1 eV，根据标准图谱对比可知Te为0价。

图4 Te NRs的紫外可见(a)，X透射衍射(b)，X射线光电子能谱(c)，傅里叶红外图谱(d)Fig 4 UV-vis, XRD, XPS, FT-IR images of Te NRs

红外光谱图(图4(d))揭示Te NRs与细胞表面化学基团之间可能存在的物理和化学相互作用。Te NRs表面的有机官能团:3 377 cm-1处的吸收峰(O-H伸缩)，2 929 cm-1(C-H反对称伸缩)，1 658 cm-1(C=C伸缩)，1 550 cm-1(COO-反对称伸缩)，1 237cm-1(多糖和磷脂中的P=O伸缩)、1 070cm-1(肽聚糖C-O和P-O伸缩)。结果表明，蛋白质、多糖的氨基、羰基和羟基官能团参与Te NRs的生物合成。

2.4 Te NRs的抗菌实验

图5为抑菌圈实验，图5(a)、(c)分别为大肠杆菌与芽孢杆菌的对照组(孔内为无菌水)，图5(b)、(d)分别为大肠杆菌与芽孢杆菌在Te NRs不同浓度下(单位：mg/L)的生长情况。此图表明Te NRs对革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌均具有一定的抑制效应。而且加入相同浓度的Te NRs，对大肠杆菌的抑菌圈明显大于同等条件下芽孢杆菌的抑菌圈，说明Te NRs对革兰氏阴性菌的抑菌效果优于革兰氏阳性菌；这是由于革兰氏阳性菌细胞壁厚具有更强的抵抗能力[22]。这在表1的最低抑菌浓度(MIC)也有体现。

图5 抑菌圈实验：大肠杆菌(a、b)，芽孢杆菌(c、d)Fig 5 Bacteriostatic zone test: E. coli and Bacillus

表1 Te NRs最低抑菌浓度Table 1 Minimum inhibitory concentration of Te NRs

为了进一步研究Te NRs对细菌细胞的影响，通过扫描电子显微镜(SEM)观察到有无Te NRs处理的细菌的形态学变化。选择革兰氏阳性(Bacillussubtilis)和革兰氏阴性(E.coli)作为模型细菌。如图6所示，未经处理的芽孢杆菌和大肠杆菌细胞边缘清晰，细胞壁光滑。在用Te NRs孵化2.5 h后，两者细胞表面受损和褶皱，推测Te NRs抗菌机制是其破坏细菌细胞壁或膜，这表明Te NRs可以用于抗菌应用。

图6 无Te NRs和24 mg/L Te NRs处理大肠杆菌(a,b)和芽孢杆菌(c,d)2.5h后的SEM图像Fig 6 Typical SEM images of E. coli and Bacillus cells without and with Te NRs treatment at 24 mg/L for 2.5 h

2.5 Te NRs对过硫酸盐降解RhB的催化性能

2.5.1 RhB在不同体系中的降解情况以及Te NRs/PMS体系降解RhB的影响因素

为了确定生物源Te NRs作为过一硫酸氢钾复合盐(PMS)催化剂的潜力，我们讨论了RhB自身以及在Te NRs、PMS、Te NRs/PMS 3种体系中的降解，并评价其催化性能(图7(a))。RhB本身不降解，仅添加Te NRs时，RhB也不降解。单独加入PMS，RhB降解缓慢，150 min内仅降解53%。在Te NRs/PMS中，RhB在150 min内降解95%以上，在180 min内完全降解。

图7 RhB在不同体系中的降解情况 (a)c(RhB)=20 mg/L,c( Te NRs)=0.12 g/L,c( PMS)=0.4 g/L, pH=7;影响Te NRs/PMS系统降解的因素 (b)Te NRs浓度，c(RhB)=20 mg/L, c(PMS)=0.4 g/L, pH=7, 35℃; (c)pH，c(RhB)=20 mg/L,c( PMS)=0.4 g/L,c( Te NRs)=0.12 g/L, 35℃; (d)温度，c(RhB)=20 mg/L, c(PMS)=0.4 g/L, pH=7, c(Te NRs)=0.12 g/LFig 7 Degradation of RhB in different systems

2.5.2 降解途径分析

图8 (a)淬灭实验c(RhB)=20 mg/L,c( TeNRs)=0.12 g/L, c(PMS)=0.4 g/L, pH=8, 35℃, c(BQ)=500 mmol/L, c(EtOH)=500 mmol/L, c(TBA)=500 mmol/L; (b)Rhb在TeNRs/PMS体系中降解的紫外可见光谱Fig 8 (a) Quenching experiment: c(RhB)=20 mg/L, c( TeNRs)=0.12 g/L, c(PMS)=0.4 g/L, pH=8, 35℃, c(BQ)=500 mmol/L, c(EtOH)=500 mmol/L, c(TBA)=500 mmol/L;(b) UV-Vis spectra of Rhb degradation in TeNRs/PMS system

3 结 论