单丛茶香气物质基础分析

卢丹敏，巢 瑾，银飞燕，刘福益，柯中楠，叶汉钟，黄建安,*，刘仲华,*

（1.湖南农业大学茶学教育部重点实验室，国家植物功能成分利用工程技术研究中心，植物功能成分利用省部共建协同创新中心，湖南长沙 410128；2.湖南省茶业集团股份有限公司，湖南 长沙 410128；3.宋凰生态茶业有限公司，广东 潮州 521000）

乌龙茶（青茶）是中国茶类的代表，主产于福建、广东和台湾三省，在国外主要产于东南亚国家、新西兰北岛以及部分非洲国家[1]。在所有茶叶类型中，乌龙茶是独一无二的，因为乌龙茶属于半发酵型茶叶，介于红茶和绿茶之间[2]。不同氧化程度给乌龙茶品质创造了无限的可能性[1]。乌龙茶以滋味醇厚、天然的花果香而名闻天下，要生产出品质优异的乌龙茶，必须在特定的时间收集茶叶。其次，必须用特定加工方法处理茶叶。福建乌龙茶以闽北的武夷岩茶和闽南的铁观音为主；中国台湾以冻顶乌龙为主；广东省乌龙茶以单丛茶为主[3]。单丛茶（分为凤凰单丛和岭头单丛）是一种传统名茶，产自广东潮州，以浓郁多变的花果蜜香和浓醇的滋味品质著称[4]。潮州潮安和饶平2个地区茶叶品质差异主要与茶叶品种、土质状况、海拔地形以及天气条件密切相关。潮安区茶叶主要产自凤凰镇凤凰山，以生产凤凰单丛为主，其品种香型多变，品质风格独特；饶平县茶叶主要产自浮滨镇岭头村双髻娘山，以生产岭头单丛为主，其品种为白叶品种，香型以蜜兰香为主。单丛茶是用2～4叶、芽叶完整的对夹叶，经过采摘、晒青、摊凉、碰青、杀青、揉捻、烘焙等工艺加工而成[5-6]。因制茶品种和工艺参数的不同，不同香型单丛茶品质特点也不尽相同。根据香型可分为黄枝香、芝兰香、玉兰香、蜜兰香、杏仁香、姜花香、肉桂香、桂花香、夜来香、茉莉香、柚花香、橙花香、杨梅香等产品[7-8]。

目前，有多种方式可对茶叶中的挥发性物质进行提取，包括减压蒸馏萃取法、同时蒸馏萃取法、超临界流体萃取法、顶空固相微萃取法和溶剂辅助风味蒸发法等[9]。顶空固相微萃取是20世纪90年代逐渐发展的样品提取技术，由于其具有需样量较小、处理时间短、能收集样品中绝大部分的挥发性成分等优点[10-11]，现已成为单丛茶叶挥发性成分提取的常用方法。国内已有很多关于单丛茶挥发性成分的研究报道，不同香型单丛茶挥发性成分的研究居多。研究表明，单丛茶中主要挥发性成分为芳樟醇、橙花叔醇、脱氢芳樟醇、吲哚、芳樟醇氧化物等[9,12-18]。已发表的研究主要采用相对定量方法检测分析单丛茶香气物质，且未从香气属性、阈值等方面研究单丛茶整体的香气风味特征。故本研究采用茶叶感官审评及气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）等技术手段对单丛茶香气成分进行检测，并结合绝对定量方法、气味活度值（odor active value，OAV）等多种统计分析方法，以期系统研究单丛茶香气化学品质的物质基础，为单丛茶品质提升提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

22个单丛茶样（D1～D22）均为2019年茶叶，均出自潮州当地饶平和凤凰2个地区。D1～D8为饶平地区茶叶，D9～D22为凤凰茶区茶叶，由揭阳市景福茶业有限公司、潮州市天羽茶业有限公司及宋凰生态茶业有限公司等当地知名茶叶企业提供。其中包括不同香型凤凰单丛茶样9个：姜花香、桂花香、柚花香、肉桂香、玉兰香、蜜兰香、黄枝香、杏仁香、银花香。样品收集后于阴凉干燥处保存。

氯化钠、无水乙醇（均为色谱纯） 国药集团化学试剂有限公司；C8～C40偶数正构烷烃标准品 美国o2si公司；1-辛烯-3-醇（≥98%）、雪松醇（≥99%）、苯甲醛（≥99.5%）、水杨酸甲酯（≥99%）、癸酸乙酯美国Sigma-Aldrich试剂公司；α-松油烯（≥99%）、3-蒈烯（≥99%）、α-松油醇（≥97%）、芳樟醇（≥98%）、香叶醇（≥97%）、庚醛（≥95%）、β-环柠檬醛（≥95%）、癸醛（≥97%）、2-庚酮（≥99%）、α-紫罗酮（≥92%）、香叶基丙酮（≥99%）、萘（≥99%）、棕榈酸甲酯（≥97%）、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚（≥99.8%）、橙花叔醇（≥97%）、顺式-3-己烯基苯甲酸酯（≥98%）、吲哚（≥99%）、D-柠檬烯（≥95%）、6-甲基-5-庚烯-2-酮（≥97%） 北京J&K公司；β-紫罗酮（≥97%）、邻苯二甲酸二异丁酯（≥99%）、橙花醇（≥97%） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 仪器与设备

EPFO-984TA7CHSEUA数显型磁力加热搅拌器美国Talboys公司；5190-1494手动进样针、7890B-5977A GC-MS联用仪 美国Agilent公司；65 μm PDMS/DVB固相微萃取头 美国Supelco公司；15 mL样品瓶上海安谱科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品处理

采用五点取样法在每份茶样的不同位置进行取样、合并和磨碎。而后在每个茶样中各取10 g磨碎样进行混合作为样本QC。取100 g QC样本于旋转蒸发的圆底烧瓶中，在60 ℃条件下不断补水旋蒸，直至检测不到挥发性成分（信噪比＜3），而后将其冷冻干燥制成空白基质样本。各磨碎样本、QC样本与空白基质样本分别置于干燥器中常温保存。

1.3.2 单丛茶香气感官评价

感官审评小组均由本课题组6 位老师和学生组成，具有长期茶叶感官审评经验。采用GB/T 23776ü2018《茶叶感官审评方法》柱形杯法对22个单丛茶样品进行感官审评，对单丛茶香气进行感官评价。结合单丛茶香气特点及样品本身特点确定香气属性。每位评价员独立对各个属性进行感官评价打分。其中“0”代表没有，“10”代表强度最高。取均值作为最终评分。

1.3.3 单丛茶挥发性成分萃取

根据文献[19]中最优萃取条件进行萃取。

1.3.4 GC-MS分析条件

GC条件：HP-5MS色谱柱（30 mh0.25 mm，0.25 μm）；载气为氦气（纯度＞99.999%）；进样口温度250 ℃；柱流速1 mL/min；进样方式为脉冲不分流；根据文献[19]方法设置升温程序。所有样品重复3次。

MS条件：电子电离源；离子源温度230 ℃；接口温度250 ℃；能量70 eV；四极杆温度150 ℃；扫描方式为全扫描模式，用于物质定性以及选择离子扫描，用于物质定量，质量扫描范围35～450 u。每个物质选定3个定性离子和1个定量离子进行检测。

1.3.5 单丛茶挥发性成分定性分析

依据文献[19]方法对单丛茶挥发性物质进行谱库定性、保留指数（retention index，RI）定性和标准品定性。谱库筛选标准为匹配度大于80%。

1.3.6 单丛茶挥发性成分定量分析

标准曲线制作[20]：以乙醇为溶剂，将各挥发性物质成分标准品配成一定质量浓度的单标。取各单标配成5个质量浓度梯度的混标，分别加入带有0.75 g空白基质样本和磁力转子的15 mL样品瓶中，再加入带有10 μL癸酸乙酯内标（8.64 mg/L）和0.5 g氯化钠的5 mL沸水。在相同条件下萃取和检测，每个质量浓度梯度重复3次。以标准品质量浓度为横坐标，标准品峰面积与内标峰面积比为纵坐标，建立标准曲线。同时在该方法下检测各物质的检出限及定量限。

样品挥发性物质定量[20]：MS扫描方式为离子模式，每个物质选择1个定量离子和3个定性离子。通过标准曲线对所分析化合物进行定量分析，对没有标准品的化合物，采用官能团相同、碳原子数相近的标准品进行估算。

1.4 数据处理

OAV为某挥发性成分质量浓度（Ci）与其阈值（OTi）之比，比值大于1的被认为是对香味有贡献的物质[20]。结合单丛茶挥发性成分定性结果查找相关文献[20-25]获得阈值。

本研究使用Agilent MassHunter 7.0进行挥发性物质定量分析；使用IBM SPSS Statistics 23.0进行数据处理和相关分析（Pearson相关系数法）；使用SIMCA-P 14.1软件进行主成分分析（principal component analysis，PCA）、聚类分析和正交偏最小二乘法判别分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）。并由SIMCA-P 14.1和Origin 2018软件绘图完成。

2 结果与分析

2.1 单丛茶香气描述性感官分析

9种凤凰单丛的香气以花果蜜香为主。其中，蜜兰香、银花香、柚花香、姜花香、玉兰香和黄枝香的香气特征表现典型。蜜兰香的感官审评评价在9个香型茶中最佳。

根据香气描述分析结果（表1），将22个样品分成了3 组，第1组（D1、D2、D3、D4、D5、D6、D7、D19、D21）包括9个样品，从其香气感官性质强度可以看出，这组样品的香气以蜜香为主，花香属性强度参差不齐，火功香和木香强度较弱，个别样品较强，因此定义为蜜香组。第2组（D13、D14、D15、D16、D17、D18、D20）包括7个样品，从其香气感官性质强度可以看出，这组样品的香气以花香为主，蜜香强度居中，火功香和木香强度较弱，定义为花香型单丛茶。第3组（D8、D9、D10、D11、D22）包括5个样品，从其香气感官性质强度可以看出，这组样品火功香强度大，木香也比其他2 组强，为火功香型单丛。D12木香强度大，其他属性强度较弱，其感官香气以清香为主，带木香，为其他型单丛。

表1 单丛茶香气品质描述性分析结果Table 1 Sensory descriptive analysis of Dancong tea aroma quality

2.2 单丛茶挥发性物质定性分析

对各个单丛样品进行GC-MS分析，结果见表2。共检测出73种挥发性化合物，主要包括醇类（19种）、酮类（11种）、醛类（10种）、酯类（7种）、酚类（2种）、碳氢化合物（18种）、含氮化合物（4种）、杂氧化合物（2种）8大类。

表2 单丛挥发性成分定性结果Table 2 Quantitative results of volatile components in Dancong tea

续表2

2.3 单丛茶挥发性物质定量分析

2.3.1 标准曲线的建立

用QC茶样作为空白基质，消除了基质效应对单丛茶挥发性成分的影响。在优化萃取条件下建立26个化合物标准曲线（表3），用于单丛茶73种挥发性成分的定量分析。26种挥发性成分的定量标准曲线线性系数R2值介于0.990 2～0.999 5之间，说明建立的标准曲线可以很好地对待测物质进行定量分析。

表3 单丛茶挥发性成分定量标准曲线Table 3 Analytical figures of merit for quantitative analysis of volatile components in Dancong tea

2.3.2 不同香型单丛茶挥发性组分定量分析

单丛茶挥发性成分虽具有一定的共性，其组成及含量也存在一定的差异。9种凤凰单丛的主要挥发性组分结果（含量前10）如表4所示。分析结果表明，吲哚和脱氢芳樟醇在这9个样品均检测到，且属于含量最多的2种挥发性物质；芳樟醇、茉莉内酯、臧红花醛和β-环柠檬醛在9个样品均检测到，属于含量较多的挥发性物质；橙花叔醇、苯乙腈和α,4-二甲基-3-环己烯-1-乙醛均在某一样品中含量较少，而在其他8个样品中含量较多。

表4 不同香型单丛茶主要挥发性成分Table 4 Major volatile components of different aroma types of Dancong tea

在单丛茶挥发性组分中，醇类物质含量最多（图1）。它以花果香物质为主，对单丛茶香气起重要贡献。醇类化合物包括了1-辛烯-3-醇（蘑菇香）、庚醇（青草香）、4-萜烯醇（胡椒香）、雪松醇（木香），以及多种花果香属性的物质，如：芳樟醇及其氧化物、橙花醇、香叶醇、橙花叔醇、植醇（表2）。醇类化合物多表现为花果香，是单丛茶香气形成的重要化合物。这与相关文献[9,12,17-18]研究结果一致。在不同香型单丛茶中，银花香的脱氢芳樟醇和橙花叔醇含量较多，使其醇类化合物总量最多，而玉兰香明显最少（图1）。

在单丛茶挥发性组分中，含氮化合物含量次之（图1），包括1-乙基吡咯、苯乙腈和吲哚等化合物（表2）。在蜜兰香茶中，苯乙腈含量明显最少，这使蜜兰香茶的含氮化合物含量明显少于其他香型；在桂花香茶中，苯乙腈含量最多，这使桂花香茶的含氮化合物含量较多；而银花香的含氮化合物含量最多，主要是由于其吲哚的含量远大于其他香型的含量。银花香，即常说的鸭屎，是一类品质优异、花香四溢的浓花香型单丛，深受消费者的喜爱[26]。而它的醇类化合物、含氮化合物含量远大于其他香型，这2类挥发性物质的组成比例对银花香香气的形成起重要作用。

在单丛茶挥发性组分中，醛类化合物、碳氢化合物、酯类化合物和酮类化合物各含量在3 000～10 000 μg/L左右，这4类化合物和醇类化合物、含氮化合物构成了单丛茶香气的物质基础（图1）。醛类化合物包括庚醛（草香）、(E,E)-2,4-庚二烯醛（草香）、丁香醛C（甜花香）、臧红花醛（草香）、α,4-二甲基-3-环己烯-1-乙醛（草香）、β-环柠檬醛（青草香）、香叶醛（甜果香）等物质（表2），其中，表现为青草香属性的臧红花醛、α,4-二甲基-3-环己烯-1-乙醛、β-环柠檬醛含量较多。在单丛茶中检测出的碳氢化合物达18种，但每种化合物的含量基本较少。蜜兰香、玉兰香的碳氢化合物含量明显低于其他香型（图1）。酯类化合物包括水杨酸甲酯（薄荷香）、茉莉内酯（奶香）、顺式-3-己烯基苯甲酸酯、邻苯二甲酸二异丁酯、棕榈酸甲酯（脂香）等物质（表2）。其中，茉莉内酯的平均含量最多。由于银花香和桂花香的茉莉内酯含量远大于其他香型茶含量，因而这两个香型的酯类化合物含量远超其他香型（图1）。酮类化合物包括2-庚酮（果香）、6-甲基-5-庚烯-2-酮（果香）、2,3-辛二酮（青草香）、2,2,6-三甲基环己酮（蜂蜜香）、顺茉莉酮（花香）、α-紫罗酮（花香）、香叶基丙酮（花香）以及β-紫罗酮（木香）等化合物（表2）。其中以花香属性的顺茉莉酮和香叶基丙酮含量最多。9个香型单丛茶的酮类化合物质量浓度为5 000 μg/L左右，差异不大。另外，杏仁香和姜花香茶的6-甲基-5-庚烯-2-酮（果香）含量明显较多，这一物质可能对杏仁香和姜花香的形成起重要作用。单丛茶酚类化合物和杂氧化合物含量最少，不同香型之间含量差异不大（图1）。

图1 9种香型单丛茶挥发性组分含量Fig.1 Contents of volatile components of nine aroma types of Dancong tea

2.4 不同香型单丛茶相关分析与聚类分析

基于单丛茶挥发性物质数据，采用Pearson相关系数法对各香型单丛茶做相关分析（表5）。结果表明，银花香除了与玉兰香相似度较高外，与其他香型的相似度均低于0.85。桂花香与8个香型的相似率比较低，仅在0.493～0.778之间。银花香、桂花香是较为独特的2类单丛茶。在聚类分析（Wald法）中，银花香、桂花香被单独分出，姜花香、肉桂香和黄枝香被聚为一类，而在相关分析中，两两香型之间的相似率也达到0.95以上。其余4个香型聚为一类（图2）。

表5 不同香型单丛茶相关性Table 5 Correlations between different aroma types of Dancong tea

图2 不同香型单丛茶聚类树状图Fig.2 Dendrogram obtained by clustering analysis of different aroma types of Dancong tea

2.5 OAV分析

根据定性定量结果并结合参考文献[20-25]，共计算35种成分的OAV。OAV大于1的化合物被认为对香味有贡献[22]。在22个单丛茶样品中共有29种挥发性成分OAV大于1，被认为是对单丛茶呈香有贡献的香气成分，因苯乙腈和3-蒈烯由于超过半数样品的OAV小于1，故不加入考虑（表6）。

表6 单丛茶特征挥发性成分的OAV和VIP值Table 6 OAV and VIP values of aroma components in Dancong tea

续表6

2.6 香气成分与香气属性关联分析

结合香气描述性感官分析结果、挥发性组分定量结果以及OAV分析结果，对22个单丛茶各香气属性与香气成分做相关分析，见表7。结果表明单丛茶中与花香呈最大正相关的香气组分为异丁香酚（相关系数0.439），呈极显著负相关的是庚醛（相关系数-0.627，P＜0.01），其次为癸醛（相关系数-0.534，P＜0.01）。对蜜香影响最大的香气组分是异丁香酚（相关系数0.430），表现为甜香，雪松醇（木香）与蜜香呈极显著（P＜0.01）负相关（相关系数-0.667）。与蜜香和花香呈最大正相关的成分均为异丁香酚，但与蜜香相比，花香属性具有很多表现为花香的挥发性成分，与其表现为正相关，且相关系数与异丁香酚差距不大，如吲哚（相关系数0.417），芳樟醇（相关系数为0.358）。二者香气成分种类具有一定的相似性，但香气物质的组成比例差异是造成二者风味各异的原因。

表7 单丛茶香气成分和香气属性间相关关系Table 7 Correlations between aroma components and aroma attributes in Dancong tea

与火功香呈极显著（P＜0.01）正相关的香气组分为庚醛（草香）、3-异丙基甲苯、氧化芳樟醇I（土香）、(E,E)-2,4-庚二烯醛（脂香）、β-蒎烯（木香）、α-紫罗酮（花香）、D-柠檬烯（甜香果香）、(E)-3,7-二甲基-1,3,6-辛三烯；与木香呈极显著（P＜0.01）正相关的香气组分为氧化芳樟醇I（土香）和3-异丙基甲苯。另外，表现为木香的挥发性成分（β-紫罗酮、雪松醇、β-蒎烯、α-松油醇、4-萜烯醇）与木香属性的相关性均超过0.32。总体上，木香成分与单丛茶木香属性的相关性大于其与单丛茶其他属性的相关性。单丛茶火功香与木香属性具有一定的关联性，二者呈极显著（P＜0.01）正相关关系。

2.7 PCA与OPLS-DA

利用OAV分析结果和香气描述性感官分析结果，将22个样品进行PCA，提取6个PC，共解释83.32%的原始数据，能较全面的解释全部变量的化学信息。根据PC1和PC2综合指标，形成二维得分散点图。如图3所示，蜜香型单丛较好地聚为一类，而花香型单丛样品基本分属在另一区域内，火功香单丛有2个样本得分点落在花香型单丛区域中，其余3个样本分散在95%置信区间边缘线左右。

图3 单丛茶香气成分PCA得分图Fig.3 PC1 versus PC2 score plot for aroma components in 22 Dancong tea samples

根据香气描述性感官分析结果和PCA结果，对花香型和蜜香型两类单丛茶进行OPLS-DA两两比较，如图4所示。从图4A可以看出，蜜香型与花香型样品分别分布于纵坐标轴的两侧，两组间差异明显。此外，D15在95%置信区间以外，原因可能在于该样品香型为银花香，俗称鸭屎香，与其他香型单丛茶相比，其香气特殊性明显，香气成分组成与其他香型的差异较大。OPLS-DA模型的统计参数=0.693、=0.805和Q2=0.54，表明所建模型适用性和预测性良好。

模型的质量交叉验证检验置换检验次数为200次，蜜香型R2=0.282，Q2=-0.592（图4C），花香型R2=0.287，Q2=-0.545（图4D），预测点的截距值均低于原始模型，表明该OPLS-DA模型不存在过拟合现象。结合预测变量投影重要性（VIPpred＞1）分析可知（图4B），蜜香型单丛茶中的吲哚、3-异丙基甲苯、6-甲基-5-庚烯-2-酮、芳樟醇、(E)-3,7-二甲基-1,3,6-辛三烯、橙花叔醇、β-蒎烯、D-柠檬烯与花香型单丛存在差异，可作为区分二者的主要香气成分。这些成分多表现为花香，在花香型单丛中的含量均多于蜜香型单丛。

图4 花香型和蜜香型单丛茶香气成分OPLS-DAFig.4 OPLS-DA analysis of aroma components in two aroma types of Dancong tea

3 讨 论

采用绝对定量分析测定9种香型单丛茶中挥发性成分含量，结果表明单丛茶挥发性物质以醇类化合物为主，多表现为花果香。银花香和桂花香表现较为独特，其醇类化合物、含氮化合物和酯类化合物总量与其他香型差异较大。“鸭屎”（俗名）是乌龙茶中高香的品种，其加工制成的茶叶表现出类似于金银花香的香气，因而“鸭屎香”后改名为“银花香”。银花香香气独特，除了杏仁香、栀子花香外还包含其他丰富的香气，已成为了近几年最受欢迎的凤凰单丛茶[26]。在挥发性物质组成方面，银花香的挥发性物质组成、比例在其他香型中也表现较为独特。在感官审评中，尽管桂花香没有表现出典型的桂花香味，其独特的品种香依旧表现在挥发性物质检测结果中。Lin Jie等[29]发现来源非常近的乌龙茶茶叶品种，芳香物质组成的差异显著，这表明品种的特征优于其他特征（如产地和质量）。不同香型的单丛茶叶因其品种和工艺参数不同，其品质特点和挥发物质组成均不尽相同。

对单丛茶花香影响（正相关）较大的香气组分是异丁香酚、吲哚、芳樟醇、橙花叔醇、水杨酸甲酯等，对蜜香影响（正相关）较大的组分是异丁香酚和橙花叔醇。火功香与木香呈极显著（P＜0.01）正相关，木香与蜜香呈显著（P＜0.05）负相关。在单丛茶加工工艺中，做青和焙火是影响其香气最为关键的工序。Ma Chengying等[30]发现萎凋阶段的挥发性化合物少于摇青半发酵阶段的挥发性化合物，表明乌龙茶的特征挥发性化合物可能在做青阶段由生物反应和热化学反应转化形成。Hu Cijie等[31]发现随着做青程度增加，萜类挥发物占比持续增加，绿叶挥发物占比下降，这一结果是通过调节萜类代谢途径和长链脂肪酸酶解途径产生，该研究还指出萜类挥发物与绿叶挥发物比值高是乌龙茶呈现特征性花香品质的关键化学基础。在单丛茶焙火过程中，木炭燃烧，使臭青气充分挥发，形成独特的木香。在这一过程中，主要发生脱水糖化作用，形成蜜糖香；异构化作用，挥发低沸点的青气物质；氧化作用，醛类、醇类等物质氧化分解，与氨基酸结合生成利于品质的香气[32]。但乌龙茶焙火工艺极其复杂，对温湿度把握要求极高，稍有不当就会出现高火香，焦杂味。从PCA和OPLS-DA结果看，花香型和蜜香型单丛茶能较好分属不同区域，所建模型适用性和检验效果良好。吲哚、3-异丙基甲苯、6-甲基-5-庚烯-2-酮、芳樟醇、(E)-3,7-二甲基-1,3,6-辛三烯、橙花叔醇、β-蒎烯、D-柠檬烯等物质在2种类型单丛中存在差异，可作为区分二者的主要香气成分。火功香型单丛茶分属不明显，主要是由于样品数量有限，仅有5个，还不足以表现出这一类明显的香气成分特征，因此，本研究仅从花香型和蜜香型单丛展开OPLS-DA，后期还需进一步增加具有典型性的样品数量研究这类样品的香气特征。另外，由于所用标准品种类较少，仅占检测出的物质种类的三分之一，虽然利用结构相似性替用标曲，后续还应加大标准品种类，尤其是单丛茶的主要香气组分-醇类物质，以提高数据精确性。