羊脂肪关键香气成分分析

杜文斌，王羽桐，徐玉霞，谢建春*

（食品质量与安全北京实验室，北京食品风味化学重点实验室，北京工商大学，北京 100048）

我国羊肉产量大[1]，作为羊肉加工副产物，羊脂肪资源丰富，但其深加工技术匮乏，导致资源浪费。动物脂肪对肉类特征风味的形成有重要贡献[2-4]，尤其羊脂肪对提升羊肉类食品如涮羊肉的羊肉特征风味有明显作用，但食用动物脂肪会给健康带来隐患，其利用很有限。肉味香精是一类可赋予食品肉类风味的食品添加剂，在方便食品、休闲食品以及速冻食品等行业需求量大[5]。研究羊脂肪的风味物质构成，对研发羊肉味香精及促进羊脂肪在食品中的深度利用尤为重要。

迄今，关于羊脂肪挥发性成分研究已有较多报道[6-10]。例如，Caporaso等[6]采用水蒸气蒸馏-冷阱收集的方法结合气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）分析了绵羊脂肪挥发性成分。谢建春等[7]采用超临界二氧化碳萃取结合GC-MS分析了调控氧化的精炼羊脂肪中的挥发性成分。Watkins等[8]分别采用同时蒸馏萃取和固相微萃取结合GC-MS分析了绵羊皮下脂肪挥发性成分。Vasta等[9]采用固相微萃取结合GC-MS分析比较了不同方式喂养羔羊脂肪挥发性成分。Sivadier等[10]采用动力学顶空-GC-MS分析了持续牧草喂养羔羊脂肪的挥发性标志物。基于以上研究，人们已从羊脂肪中检测出大量的醛、酮、醇、羧酸、酯等挥发性物质，并认为羊脂肪组织中的代谢物4-甲基辛酸和4-乙基辛酸对羊肉膻味起主要贡献[11-13]。

食品风味分析中，GC-MS分析可获得样品的挥发性物质构成信息，考察对样品整体香气成分有贡献的关键物质，还需采用气相色谱-嗅闻（gas chromatographyolfactometry，GC-O）手段进行分析。GC-O为一种将气相色谱高效分离与人鼻的嗅觉灵敏性相结合的技术，GC-O分析的检测方法主要包括频率法、强度法和香气萃取物稀释法（aroma extract dilution analysis，AEDA）[14-15]。AEDA的操作过程是：将样品逐级稀释并GC-O分析，化合物能被嗅闻到气味时的最高稀释倍数记为风味稀释（flavor dilution，FD）因子，FD值越大表示对整体香气的贡献越大，因而经AEDA/GC-O分析可筛选出样品中对整体香气贡献大的化合物[14-16]。

溶剂辅助蒸发（solvent assisted flavor evaporation，SAFE）法利用高真空蒸馏的原理将溶剂萃取物中的风味物质进行分离，操作温度接近室温，处理条件温和，得到的风味浓缩物接近真实的样品，近年在食品风味分析上得到了广泛应用。本实验前期采用SAFE结合GC-MS、AEDA/GC-O成功地分析了黑猪肉汤[17]、炖煮北京油鸡肉汤[18]、山西老陈醋[16]、新鲜蒜黄[19]、烤羊肉[20]的关键香气物质。本实验采用SAFE装置直接蒸馏挥发性组分，再结合GC-MS、AEDA/GC-O研究羊脂肪的关键香气物质。研究结果可为羊肉味香精的制备及羊脂肪的开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

羊腹部脂肪 永辉超市；二氯甲烷（色谱纯）国药集团化学试剂有限公司；C5～C29正构烷烃（色谱纯）北京化学试剂有限公司；邻二氯苯（≥98%）、丙烯醛（≥98%）、丁醛（≥98%）、戊醛（≥98%）、己醛（≥98%）、庚醛（≥98%）、辛醛（≥98%）、(E,E)-2,4-己二烯醛（≥98%）、(E,E)-2,4-庚二烯醛（≥98%）、(E)-2-辛烯醛（≥98%）、(E)-2-癸烯醛（≥98%）、(E)-2-壬烯醛（≥98%）、(E,E)-2,4-辛二烯醛（≥98%）、(E,E)-2,4-壬二烯醛（≥98%）、(E,E)-2,4-癸二烯醛（≥98%）、(E)-2-十一烯醛（≥98%）、(E)-2-十二烯醛（≥98%）、十三醛（≥98%）、十五醛（≥98%）、苯甲醛（≥98%）、糠醛（≥98%）、噻吩（≥98%）、2-甲基噻吩（≥98%）、2,4-二甲基噻唑（≥98%）、糠硫醇（≥98%）、3-甲硫基丙醛（≥98%）、2-噻吩甲醛（≥98%）、4-甲基噻唑（≥95%）、4,5-二甲基噻唑（≥98%）、2,5-二甲基吡嗪（≥95%）、四甲基吡嗪（≥98%）、2,6-二甲基吡嗪（≥98%）、三甲基吡嗪（≥98%）、1-辛烯-3-醇（≥97%）、2-庚醇（≥95%）、辛醇（≥98%）、苯乙醇（≥97%）、2-十一酮（≥98%）、乙酸（≥95%）、丁酸（≥98%）、2-甲基丙酸（≥98%）、2-甲基丁酸（≥98%）、3-甲基丁酸（≥98%）、己酸（≥98%）、辛酸（≥98%）、壬酸（≥98%）、二甲基亚砜（≥95%）、5-丁基-二氢-2(3H)-呋喃酮（≥98%）、2(5H)-呋喃酮（≥95%）、庚烷（≥90%）、辛烷（≥90%）、十七烷（≥90%）、麦芽酚（≥98%）、苯酚（≥98%）、对甲酚（≥98%）、4-甲基辛酸（≥98%）、4-乙基苯酚（≥98%）、吲哚（≥98%）北京百灵威科技有限公司；脂肪酸甲酯标准品（色谱纯） 上海安谱实验科技有限公司。

1.2 仪器与设备

7890A-5975C型GC-MS联用仪 美国Agilent公司；气味测量仪 美国DATU Inc公司；电磁炉 杭州九阳生活电器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 脂肪酸分析

参照GB 5009.168ü2016《食品中脂肪酸的测定》进行。准确称取羊脂肪60 mg加入4 mL异辛烷中，加内标参比液十七烷酸甲酯（溶于异辛烷，5 g/L，2 mL）、200 μL氢氧化钾-甲醇溶液（2 mol/L），猛烈振摇30 s后静置，将上层溶液转移到具塞玻璃试管中，加入1 g硫酸氢钠，猛烈振摇，静置，取上层溶液参照文献[21]进行GC-MS分析，通过检索质谱库及与采用脂肪酸甲酯标品，对脂肪酸进行鉴定。脂肪酸甲酯含量先按式（1）计算，再根据国标中脂肪酸甲酯和脂肪酸之间的转化系数计算各脂肪酸含量：

式中：xi为脂肪酸甲酯含量/（mg/g）；Ai为脂肪酸酯峰面积；As为十七烷酸甲酯的峰面积；V0为异辛烷体积/mL；Cs为十七烷酸甲酯质量浓度/（g/L）；m为羊脂肪质量/mg。

1.3.2 SAFE提取

羊脂肪（500f0.1）g，切成1 cmh1 cmh1 cm的小块，放入铁炒锅，电磁炉加热，不断搅拌，加热温度（130f5）℃，加热时间20 min。取加热后的羊脂肪冷却至室温，SAFE装置直接蒸馏处理。恒温水槽温度50 ℃，SAFE的蒸馏头夹层循环水温度为30 ℃，液氮冷凝，系统内压力保持10-5Pa左右，收集样品0.3 mL。

1.3.3 挥发性成分GC-MS分析

DB-WAX色谱柱（30 mh0.25 mm，0.25 μm），柱温40 ℃，4.5 ℃/min升至180 ℃，然后7 ℃/min升至230 ℃。载气为He，流速1 mL/min。进样口温度250 ℃；不分流模式，进样量1 μL。

电子电离源，能量70 eV；离子源温度230 ℃；四极杆温度150 ℃；全扫描模式，质量扫描范围50～450 u；辅助加热线温度230 ℃。

在相同GC-MS条件下进样C5～C29正构烷烃，按式（2）计算保留指数（retention index，RI）：

式中：tn和t（n+1）分别为碳原子数为n、n+1的正构烷烃的保留时间；ti为出峰在n和n+1的正构烷烃间的i化合物的保留时间。

1.3.4 GC-O分析

由7890A GC装置及气味测量装置组成，毛细管柱为DB-WAX（30 mh0.25 mm，0.25 μm），起始柱温40 ℃，5 ℃/min升至230 ℃；载气为N2（纯度为99.999%），流速1 mL/min，进样口温度250 ℃，不分流模式，进样1 μL。

由3 名评价员完成，样品用二氯甲烷按1∶2、1∶4、1∶8、1∶16等逐级稀释，分别进行GC-O分析，并记录嗅闻的RI、气味特征、FD值。

1.4 数据处理

3 份样品的结果取均值为最终结果。GC-MS分析采用检索NIST11谱库、RI、标准品进样鉴定化合物。GC-O分析中，气味描述词由3 名评价员协商确定，FD值取3 名评价员的平均值，根据RI、谱库检索、气味特征及标准品比对鉴定化合物。

2 结果与分析

2.1 羊脂肪的脂肪酸分析

在加热脂肪过程中，脂肪酸发生氧化反应产生人们喜好的脂肪风味。脂肪酸组成对脂肪的风味有重要影响，不同脂肪酸的氧化速率不同，氧化产生的挥发性风味化合物不同[22-23]。如表1所示，共检测到19种脂肪酸，饱和脂肪酸533.70 mg/g（占59.97%），单不饱和脂肪酸330.26 mg/g（占37.11%），多不饱和脂肪酸25.97 mg/g（占2.92%），含量高的3种脂肪酸为棕榈酸（占29.70%）、硬脂酸（占27.48%）、油酸（占35.16%）。本实验检测到的饱和脂肪酸或不饱和脂肪酸总含量与Nizar等[24]分析羊脂肪的结果类似。本实验除了亚油酸、亚麻酸外，还检测到的几种其他多不饱和脂肪酸（如C22:5）且均含量低，这与Chin等[25]报道的羊脂肪的脂肪酸检测结果一致。

表1 羊脂肪的脂肪酸组成Table 1 Fatty acid composition of sheep tallow

2.2 羊脂肪SAFE浓缩物的GC-MS分析

GC-MS检测结果如表2所示。共鉴定出58种物质，醛类化合物10种、醇类化合物13种、酮类化合物2种、酸类化合物10种、呋喃类化合物4种、吡嗪类化合物5种、含硫化合物8种、其他化合物6种。含量较高的化合物（＞3 μg/kg）有1-己醇、1-辛烯-3-醇、2-己醇、2,3-丁二醇、乙偶姻、乙酸、丙酸、2-甲基丙酸、己酸、二甲基亚砜。本实验检测到乙酸含量高，这与Vsata等[9]采用固相微萃取-GC-MS分析羊脂肪挥发性成分的报道一致。检测到戊醛、己醛、庚醛、(E)-2-己烯醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛、苯甲醛、苯乙醇、1-辛烯-3-醇、1-庚醇、1-戊醇、1-己醇、乙酸、辛酸、壬酸、2-甲基丁酸和3-甲硫基丙醛等，在已有的羊脂肪挥发性成分分析报道中均曾检测到[6-10]。2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、三甲基吡嗪、四甲基吡嗪，Buttery等[26]在烤羊脂肪中曾检测到。

表2 SAFE结合GC-MS分析羊脂肪挥发性物质的结果Table 2 Quantitative analysis of volatile compounds in sheep tallow by SAFE combined with GC-MS

续表2

检测到的脂肪族的醛（如戊醛）、酮（如8-壬烯-2-酮）、醇（如1-己醇）、酸（如辛酸）、烃（如庚烷），这些均为脂质氧化降解成分。其中戊醛、1-戊醇、己醛、1-辛烯-3-醇、丁醛、(E)-2-壬烯醛和2,4-癸二烯醛可来源于亚油酸的氧化降解，己醛、己酸、(E)-2-癸烯醛、壬醇等化合物可来源于油酸的氧化降解，(E,E)-2,4-庚二烯醛可来源于亚麻酸的氧化降解[22,27]。

羊脂肪组织中除了脂质，还含有少量的氨基酸、蛋白质及糖类，因而还检测到可来源于美拉德反应的化合物，包括含硫化合物如3-甲硫基丙醛、噻吩、4,5-二甲基噻唑等，吡嗪类化合物如2,5-二甲基吡嗪、苯乙醇、2-甲基丁酸和3-甲基丁酸、乙偶姻等。2-甲基丁酸和3-甲基丁酸可由亮氨酸、异亮氨酸的Strecker醛2-甲基丁醛和3-甲基丁醛氧化生成，苯乙醇可由苯丙氨酸的Strecker醛苯乙醛发生还原反应得到[28]。

2.3 羊脂肪SAFE浓缩物的GC-O分析

目前，有关羊脂肪的挥发性风味分析报道多数为GC-MS分析挥发性成分，而并未采用GC-O进行分析。本实验GC-O分析检测到37个气味活性区域，基于GC-MS鉴定结果、嗅闻的RI、气味特征、标准品比对，鉴定出37个气味活性化合物，见表3。有的化合物如糠硫醇，因含量低于GC-MS检测限，未检测到，但GC-O检测到，与这些化合物具有较低的气味阈值有关。

表3 SAFE结合AEDA/GC-O分析羊脂肪香气成分结果Table 3 Identification of aroma compounds in sheep tallow by SAFE combined with AEDA/GC-O

鉴定出的化合物中包括脂肪醛19种、脂肪醇4种、吡嗪2种、含硫化合物4种、呋喃类化合物3种等。脂肪醛类化合物是GC-O鉴定出最多的化合物，这与Bravo-Lamas等[29]分析烤羊肉的结果一致。检测到的脂肪醛类化合物主要提供青香、油脂香，吡嗪类化合物主要提供烤香，含硫化合物主要提供烤肉香，呋喃类化合物主要提供焦糖香。一般认为，在羊肉香气中，酚类和支链脂肪酸对羊肉的膻味有贡献[13,20]，因此本实验中检测到4-乙基苯酚、4-甲基辛酸，应提供了羊脂肪的特征香气（膻味）。早期Rota等[11]采用GC-O分析煮羊肉时4-甲基辛酸和4-乙基辛酸均检测到。相比之下，4-乙基辛酸的气味阈值低于4-甲基辛酸，对羊肉的膻气影响更大。而近年Resconi[30]及Bravo-Lamas[29]等采用GC-O分析烤羊肉，均未检测到任何支链脂肪酸。这很可能与近年人们为降低消费者不喜欢的羊膻气，在羊的养殖上进行改良有关[30-31]。

稀释法嗅闻中，FD值越大表明对总体香气的贡献越大。检测出FD值较大（log2FD≥4）的化合物有(E,E)-2,4-庚二烯醛、(E)-2-壬烯醛、(E,E)-2,4-辛二烯醛、(E)-2-癸烯醛、(E,Z)-2,4-癸二烯醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛、2-庚醇、三甲基吡嗪、4-甲基噻唑、3-甲硫基丙醛、5-甲基-二氢-2(3H)-呋喃酮、4-乙基苯酚。这些化合物对羊脂肪的香气起主要作用。其中(E)-2-壬烯醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛和3-甲硫基丙醛在煮羊肉中GC-O分析也检测到[11]，并具有较高FD值。Du Wenbin等[20]在烤羊肉中也鉴定出(E,E)-2,4-庚二烯醛、三甲基吡嗪、4-甲基噻唑、3-甲硫基丙醛、4-乙基苯酚，并均具有较大的FD值。Resconi等[30]在烤羊肉中也鉴定出(E,E)-2,4-辛二烯醛、(E)-2-癸烯醛。

3 结 论

羊脂肪中共检测到19种脂肪酸，饱和脂肪酸533.70 mg/g（占59.97%），单不饱和脂肪酸330.26 mg/g（占37.11%），多不饱和脂肪酸25.97 mg/g（占2.92%），含量高的为棕榈酸、硬脂酸、油酸。羊脂肪加热后经过SAFE装置萃取，GC-MS、AEDA/GC-O分析，GC-MS鉴定出58种化合物，在羊脂肪中嗅闻到37种香气活性成分，其中FD值大（log2FD≥4）的化合物有(E,E)-2,4-庚二烯醛、(E)-2-壬烯醛、(E,E)-2,4-辛二烯醛、(E)-2-癸烯醛、(E,Z)-2,4-癸二烯醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛、2-庚醇、三甲基吡嗪、4-甲基噻唑、3-甲硫基丙醛、5-甲基-二氢-2(3H)-呋喃酮、4-乙基苯酚，认为是羊脂肪的关键香气成分。研究结果可为了解羊脂肪风味构成及开发羊肉类香精提供参考。