基于BV-2 条件培养基的SH-SY5Y 共培养系统，探讨丹参酮ⅡA 对内毒素诱导神经元坏死性凋亡的保护作用#

冯梓琦 巫瑶 于洋 朱玲 万莉红△

（1.明远学园——基础医学拔尖学生培养基地（怀德班）2019 级，四川大学华西基础医学与法医学院，四川 成都 610041；2.四川大学华西基础医学与法医学院药理学教研室，四川 成都 610041；3.四川大学华西医院神经外科，四川 成都 610041）

脓毒症相关性脑病（Sepsis-associated encephalopathy，SAE）是脓毒症累及大脑而引起的弥漫性脑功能障碍，临床上主要表现为躁动、注意力下降、意识改变、睡眠节律紊乱、谵妄[1]。研究表明SAE 与脓毒症患者预后相关，可导致患者长期认知功能障碍[2]。脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）是革兰阴性菌细胞壁的主要成分，是导致脓毒症脑病的直接因素[3]。

坏死性凋亡的概念在2005 年被首次提出，被证实在精密调控下参与神经系统的正常发育[4]。目前研究发现，炎症环境中异常激活的神经细胞坏死性凋亡（Necroptosis）与多种神经系统疾病相关，如：多发性硬化、肌萎缩性侧索硬化症、帕金森症和阿尔茨海默症[5]。尤其在神经炎症时，LPS 通过直接结合小胶质细胞上的Toll 样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4）使小胶质细胞向促炎M1 样极化状态激活，产生大量的神经毒性因子和神经免疫炎症因子作用于神经元细胞[6]，在Caspase-8 活性被抑制时，受体结合丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1（Receptor-interacting protein kinase 1，RIPK1）与受体结合丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶3（Receptor-interacting protein kinase 3，RIPK3）作用，将混合谱系激酶结构域样蛋白（Mixed lineage kinase domain-like protein，MLKL）磷酸化激活，使其移位至细胞膜处并破坏膜的完整性[7]。

丹参酮ⅡA 是从中药丹参中提取出的脂溶性有效成分，临床主要用于治疗心血管疾病。课题组既往研究发现，丹参酮 ⅡA 对神经元具有一定的保护作用，可明显改善AD 小鼠的认知功能[8]。但目前尚无研究证实丹参酮 ⅡA 对SAE 神经元的保护作用，因此本文拟LPS 刺激小胶质细胞构建条件培养基诱导神经元损伤的共培养系统，探究丹参酮 ⅡA 对神经元活性以及坏死性凋亡通路蛋白MLKL 表达水平的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂

DMEM（Cytiva，美国），胎牛血清（FBS，gibco，美国），青霉素/链霉素（普诺赛，中国武汉），RIPA 裂解液（北京索莱宝科技有限公司，中国北京），CCK8 Assay Kit（PAE×BIO，美国）BCA 蛋白质测定试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，中国上海），聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（Millipore,Billerica,MA,USA），抗MLKL 单克隆抗体（1 :1000，Cell Signaling Technology，USA），小鼠单克隆抗β-actin 抗体（1:1000，Cell Signaling Technology，USA）。

1.1.2 细胞

小鼠永生化小胶质细胞株BV-2 购自武汉普诺赛生命科技有限公司（中国，武汉），人髓神经母细胞瘤细胞株SHSY-5Y 购自武汉普诺赛生命科技有限公司（中国，武汉）。

1.2 方法

1.2.1 条件培养基为基础的共培养系统构建

BV-2 细胞采用DMEM 高糖完全培养基（含10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素）常规培养后，以每孔104接种于96 孔板，每孔体积100 μL，培养24 h 后加入不同浓度LPS（0、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2 μg·mL-1）刺激24 h。取BV-2 培养上清液与DMEM 高糖完全培养基（含10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素）按照体积比1:1 混合，建立共培养系统用于培养SH-SY5Y 细胞。

1.2.2 CCK8 法测定细胞增殖能力

以上述共培养系统培养SH-SY5Y 细胞24 h后，每孔加入CCK-8 溶液10 μL。继续培养3h 后，用酶标仪（Bio-Tek，美国）测定各组样品在450 nm 处的吸光度值。

1.2.3 丹参酮IIA 对SH-SY5Y 细胞活性的影响

（1）常规培养SH-SY5Y 后以不同浓度丹参酮IIA（0、0.1、1、5、10、20、40、80、160 μM）刺激24 h，采用1.2.2 中方法测定细胞增殖能力，计算丹参酮IIA 的IC50。

（2）常规培养SH-SY5Y，以不同浓度丹参酮IIA（0、0.2、1 μM）预处理4 h 后，以上述共培养系统继续培养SH-SY5Y 细胞24 h，采用1.2.2中方法测定细胞增殖能力。

1.2.4 蛋白提取及Western blotting

收集SH-SY5Y 细胞以RIPA 裂解液裂解后在4℃下以12000 rpm 离心10 min 后取上清，稀释10 倍后用BCA 蛋白质测定试剂盒测定蛋白质浓度。取蛋白质40 μL 在10%SDS-PAGE 中进行电泳分离，并转移到聚偏二氟乙烯（Polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，室温下用5%脱脂牛奶孵化2 h 后以含0.1% Tween 20 的Tris 缓冲盐水（Tris Buffered Saline with Tween 20，TBST）洗涤三次，每次10 min，然后将PVDF 膜在小鼠抗MLKL 单克隆抗体和小鼠单克隆抗β-actin 抗体中连续孵育3 h。经TBST 洗膜三次后在室温下加入二抗孵育2 h。使用Western Lightning TM Chemiluminescence Reagent Plus 检测所有蛋白质，并使用ImagJ扫描灰度值对结果进行量化。

1.3 统计学分析

所有数据通过GraphPad Prism 8.0 进行分析，计量资料以均数±标准差（）表示，采用oneway ANOVA 方差分析检验，其中P<0.05 表示差异具有统计学差异。

2 结果

2.1 共培养系统条件优化

不同浓度梯度LPS（0、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2 μg·mL-1）刺激BV-2 小胶质细胞后收集上清作为条件培养液，与DMEM 高糖完全培养基（含10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素）按照体积比1:1 混合建立的共培养系统对SH-SY5Y细胞活性的影响呈现剂量依赖性，即随LPS 浓度递增SH-SY5Y 细胞活性逐渐下降，见图1；LPS的IC50为0.27 μg·mL-1，故确定0.2 μg·mL-1作为后续试验所需LPS 浓度。

图1 CCK8 法检测SH-SY5Y 细胞活性

2.2 LPS 刺激小胶质细胞构建条件培养系统可诱导神经元坏死性凋亡

LPS 刺激BV-2 构建条件培养系统可显著增加SH-SY5Y 细胞MLKL 蛋白表达水平（P<0.05），见图2；说明条件共培养系统中SH-SY5Y 神经元细胞发生坏死性凋亡。

图2 LPS 刺激小胶质细胞构建条件培养系统对SH-SY5Y 细胞MLKL 表达水平的影响

2.3 丹参酮ⅡA 对神经元损伤的保护作用

如图3-A 所示，随着丹参酮ⅡA 给药剂量的增加，SH-SY5Y 细胞活性逐渐下降，其 IC50为7.94 μM，因此丹参酮ⅡA后续给药剂量选择0.2、1 μM。如图3-B 所示，丹参酮ⅡA 可明显增加共培养体系中SH-SY5Y 神经元细胞活性。光镜可见条件培养基刺激使神经元数量减少、突起变短甚至消失（图4-B），而丹参酮ⅡA 预保护后神经元形态及数量改变均减轻（图4-C，D）。经WB 测定发现，丹参酮ⅡA 可明显降低LPS 刺激BV-2构建条件培养系统引起的MLKL 上调（P<0.05），见图5。

图3 CCK8 法测定丹参酮IIA 对SH-SY5Y 细胞活性的影响

图4 不同浓度丹参酮IIA 对神经元形态及数量的影响（×20）

图5 不同浓度丹参酮IIA 对神经元MLKL 水平的影响

3 讨论

小胶质细胞参与中枢神经系统的炎症反应和免疫应答。在致炎因子作用下，小胶质细胞被激活，呈现促炎表型M1 样和抗炎表型M2 样两种极化状态。脂多糖是革兰阴性菌细胞壁的主要成分，可直接结合小胶质细胞膜上的TLR-4 使其处于促炎的M1 样极化状态[9]，通过激活NF-κB 通路，释放各种炎症因子，从而对神经元细胞造成损伤[6]。在本研究中，先用LPS 对BV-2 进行24 h 刺激模拟体内内毒素激活小胶质细胞，取其含多种炎症因子的上清液培养SH-SY5Y，排除了神经元与小胶质细胞接触及其他复杂环境作用的影响，针对性地模拟了SAE 中小胶质细胞细胞介导的炎症环境所造成的神经元损伤。实验结果显示，LPS 间接刺激神经元使其增殖能力降低，形态发生异常改变、细胞数量减少。

神经元的坏死性凋亡通路在多种炎性因子作用下被激活，上调MLKL 激活后破坏膜完整性，形态异常具有坏死和凋亡的混合特征。坏死性凋亡已被证实在SAE 大鼠模型中参与神经元损伤过程，引起中枢功能异常[10]。本研究通过构建以条件培养为基础的共培养体系，在体外验证了内毒素刺激BV-2 产生的含炎症因子的上清能够上调SH-SY5Y 中的MLKL，镜下神经元间联系及树突轴突减少，胞体由圆形多边形缩小成异常梭形，核凝集固缩，发生坏死性凋亡。说明在SAE中小胶质细胞激活后介导的炎症环境即可通过诱导坏死性凋亡造成神经元损伤，引起中枢功能异常。

丹参药用历史悠久，具有活血通经、祛瘀止痛、清心除烦等功效。现代药理学证明其有保护心血管、抗炎、抗氧化等多种生物学活性。丹参酮ⅡA 是从中药丹参中提取出的脂溶性有效成分，属于菲醌类化合物衍生物，临床主要用于治疗心血管疾病。本研究结果显示，在基于LPS 刺激BV-2 的条件共培养环境中，丹参酮ⅡA 可以减轻SHSY5Y 的形态异常及数量减少，能够下调炎症刺激引起的MLKL 高表达，抑制神经元发生坏死性凋亡，缓解小胶质细胞介导的炎症环境中神经元的损伤。

在本文中，我们通过体外构建条件共培养体系，模拟脓毒症相关性脑病中内毒素激活小胶质细胞介导的炎症环境，发现丹参酮ⅡA 可以保护神经元免受坏死性凋亡造成的损伤，表明中药丹参对治疗脓毒症脑病具有较强的潜在临床应用价值。