外源海藻糖对兰州百合鳞片扦插子鳞茎数量和相关糖代谢的影响

李伟泰，黄登婧，李昌霞，王春蕾，闫梅，廖伟彪

(甘肃农业大学园艺学院，甘肃 兰州 730070)

兰州百合(Liliumdavidiivar.unicolor)是百合科(Liliaceae)百合属(Lilium)多年生草本植物，是川百合的一个变种[1]，是药食两用的甜百合[2]。碳水化合物代谢对百合鳞茎的生长发育至关重要，淀粉是百合鳞茎中碳水化合物的重要贮藏形式，百合的整个生长过程其实就是淀粉积累的过程[3]。蔗糖是植物生长发育所必需的可溶性碳水化合物，百合鳞茎的蔗糖含量占总糖含量的绝大部分，蔗糖的变化决定着总糖的变化[4]。因此，研究淀粉和蔗糖的代谢机制对了解百合鳞茎的生长发育具有重要的意义。

海藻糖是由两个分子葡萄糖组成的一种非还原性双糖，广泛存在于真菌、细菌、动物、植物等生物体内，具有重要的生物学功能[5]。海藻糖可能是调节植物基因表达和生长发育的重要信号因子[6]。研究表明，施加一定浓度的外源海藻糖可以提高植物的抗逆性。如外源海藻糖可以减轻高温胁迫对小麦幼苗的损伤[7]，也可缓解镉对水稻幼苗的胁迫[8]，此外海藻糖还可以维护渗透胁迫下西瓜细胞的正常生长，保护其亚细胞结构[9]。目前，海藻糖和海藻糖代谢已被证实在渗透保护、耐脱水、储存能量碳源、耐热性、生长发育调节和糖信号传递等过程中发挥作用[10]。在番茄中引入酵母海藻糖6-磷酸合酶(TPS1)可以提高番茄的叶绿素和淀粉含量，增强番茄对干旱、盐和氧化胁迫的耐受性[11]。但是海藻糖对百合鳞片扦插繁殖过程中碳水化合物含量的影响未见报道。因此，本文研究了外源海藻糖对百合鳞片扦插繁殖过程中母鳞片糖代谢的影响，以期为深入研究百合鳞片扦插繁殖中糖代谢机制、百合种球繁育体系奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

百合种球购买于甘肃省兰州市西果园。

1.2 试验方法

将新鲜种球用蒸馏水清洗干净，在500倍多菌灵溶液浸泡30 min。将种球用蒸馏水冲洗2次，从基部剥取中层健壮的鳞片，晾干表面水分备用。用浓度梯度为0(对照)、10、50、100、200和500 mmol/L的海藻糖溶液分别浸泡百合鳞片基部2 h。之后将百合鳞片扦插到基质(蛭石：珍珠岩体积比为3∶1)，在光照培养箱培养75 d(昼温：(23±2)℃；夜温：(19±2)℃)。各处理每隔8 d浇灌1次同等浓度海藻糖，在培养的第25、50、75天分别对母鳞片进行取样，每次15片，重复3次。取样后置于液氮中速冻，保存于-80 ℃超低温冰箱中待用。

采用蒽酮比色法测定淀粉和可溶性糖的含量[12]。蔗糖的含量测定用间苯二酚比色法[13]。

海藻糖含量及蔗糖合成酶(SuSy)、ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(AGP)和6-磷酸海藻糖合酶(TPS)活性使用ELISA试剂盒(远慕生物，中国上海)根据说明书进行测定。检测液的提取步骤具体为：取0.5 g样本用pH 7.4 的PBS缓冲液漂洗，之后加入0.05 mol/L Tris-HCl，充分研磨。将制备好的匀浆液在常温下4 000g离心15 min，取上清液进行测定。

总RNA的提取使用Trizol法[14-15]并加以改动。用液氮将样本研磨至粉末，加入1 mL TRIzol试剂，静置10 min。随后加入200 μL氯仿，离心取上清液，加入异丙醇于-20 ℃ 沉淀至少1 h。用75%的乙醇洗涤2次后45 μL无酶去离子水收集RNA。使用Evo M-ML V反转录试剂预混液(艾克瑞生物，中国湖南)合成cDNA。用SYBR Green Premix Pro Tap HS预混型qPCR试剂盒(艾克瑞生物，中国湖南)进行RT-qPCR。试验中所用到的相关引物列于表1。

表1 实时荧光定量引物序列

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 不同浓度海藻糖对百合扦插过程中子鳞茎数量的影响

如图1所示，不同浓度的外源海藻糖对百合鳞片扦插繁殖过程中子鳞茎的发生数量有显著的影响。与对照相比，10和50 mmol/L海藻糖处理下母鳞片上子鳞茎的发生数量明显增加，其中50 mmol/L海藻糖促生的子鳞茎数量最多，10 mmol/L次之(图1)。当海藻糖溶液的浓度达到100 mmol/L之后，子鳞茎的发生数量随着海藻糖浓度的增加呈现出逐渐降低的趋势，说明高浓度的海藻糖可能会抑制子鳞茎的萌发。因此，本研究选用50 mmol/L的海藻糖处理进行后续的试验。

2.2 外源海藻糖对百合扦插过程中母鳞片的淀粉、蔗糖、内源海藻糖和可溶性糖含量的影响

在外源海藻糖处理的鳞片扦插繁殖过程中，母鳞片的淀粉含量呈现整体下降的趋势(图2-A)。与对照相比，外源海藻糖处理的母鳞片淀粉含量均显著高于对照，在75 d达到极显著，比对照高29.92 mg/g。外源海藻糖也显著的提高了母鳞片的蔗糖含量，其中在50和 75 d极显著地高于对照(图2-B)。母鳞片中内源海藻糖的含量呈现先上升后下降的趋势，在25 d达到最高为4.39 mg/g。其中外源海藻糖处理的内源海藻糖含量均显著高于对照(图2-C)。扦插繁殖过程中母鳞片可溶性糖含量在对照中呈现下降趋势，而外源海藻糖处理的可溶性糖含量在0～25 d时降低，而在25～75 d时开始升高，分别比对照高6.4%、42.4%和92.5%(图2-D)。

图1 不同浓度海藻糖对百合鳞片扦插过程中子鳞茎数量的影响Figure 1 Effects of different concentrations of trehalose on the number of daughter bulbs during lily scale cutting

*表示对照和海藻糖处理处理之间的差异显著性；*表示0.05水平差异显著，**表示0.01水平差异显著。*Indicates the significance of the difference between the control and trehalose treatments；* Indicates a significant difference at the 0.05 level,** indicates a significant difference at the 0.01 level.图2 外源海藻糖对百合鳞片扦插过程中母鳞片淀粉、蔗糖和内源海藻糖和可溶性糖含量的影响Figure 2 The effect of exogenous trehalose on the content of mother scale starch,sucrose,endogenous trehalose and soluble sugar during lily scale cutting

2.3 外源海藻糖对百合扦插过程中糖代谢相关酶活性的影响

母鳞片淀粉合成相关酶AGP的活性在扦插过程中持续降低，但外源海藻糖的处理缓解了它的降低并在50、75 d时效果显著(图3-A)。以水解蔗糖为主的SuSy的活性在扦插繁殖过程中呈现逐渐增加的趋势，其在对照中的活性明显高于外源海藻糖处理(图3-B)。TPS活性在扦插过程中逐渐增加，外源海藻糖处理显著提高了其活性的增加，且在50 d时呈现出极显著的差异(图3-C)。

2.4 外源海藻糖对百合扦插过程中糖代谢相关基因转录水平的影响

如图4所示，SSS1转录水平在扦插过程中呈现下降的趋势。在外源海藻糖处理的第25天， 其转录水平显著低于对照，但在50、75 d显著高于对照(图4-A)。相反地，SBE和AGP1的转录水平在扦插过程中呈上升趋势，且在外源海藻糖处理均显著高于对照高(图4-B～C)。相比于对照，外源海藻糖显著的降低了扦插过程中SuSy1和INV2基因的转录水平(图4-D～E)，其中，SuSy1的转录水平被外源海藻糖极显著抑制，在75 d时对照中SuSy1的转录水平达到最大，比海藻糖处理高755.7%。TPS6、TPS7和TPS9的转录水平在扦插过程中呈现先上升后下降的趋势，在25 d时其基因转录水平达到最高。相比于对照，海藻糖处理推迟了TPS6和TPS7的下降。在50、75 d，外源海藻糖处理减缓了TPS6、TPS7和TPS9的转录水平，并在50 d存在显著性差异(图4-F～H)。

*表示对照和海藻糖处理处理之间的差异显著性；*表示0.05水平差异显著，**表示0.01水平差异显著。*Indicates the significance of the difference between the control and trehalose treatments；* Indicates a significant difference at the 0.05 level,** indicates a significant difference at the 0.01 level.图3 外源海藻糖对百合鳞片扦插过程中母鳞片ADP-葡萄糖焦磷酸化酶、蔗糖合成酶和6-磷酸海藻糖和酶酶活性的影响Figure 3 Effects of exogenous trehalose on ADP-glucose pyrophosphorylase,sucrose synthase,trehalose 6-phosphate and enzymatic activities of mother scales during lily scale cutting

3 讨论

海藻糖在许多生物体中被用作碳水化合物的储备物质和应激保护剂。因其所具有的不同于其他碳水化合物的独特生物学特性，海藻糖可以在干旱、高温、冷冻、脱水、高渗透等恶劣环境下保护生物体的细胞、蛋白质、糖类、核酸等组分不受损伤[16-18]。邹德堂等[19]研究发现，10 mmol/L海藻糖处理的水稻幼苗总根长、根数、株高、存活率都有所提高，并且可以缓解碱胁迫对水稻幼苗造成的伤害。魏彬[20]的研究表明，海藻糖还可以提高低温胁迫小麦幼穗的可孕天数，增加穗粒数。在本研究中，我们探讨了外源海藻糖对百合扦插繁殖过程的影响，结果发现低浓度的外源海藻糖处理显著提高了百合鳞片子鳞茎的发生，而高浓度的海藻糖会抑制子鳞茎的发生。陈素丽等[21]研究认为，高浓度的海藻糖可能会影响植物对碳水化合物的利用，从而抑制植物的生长。同样金军民等[22]也表明适宜浓度的海藻糖能够促进生菜根系的生长。外源施用高浓度的海藻糖可能会取代植物中蔗糖的地位，进而影响韧皮部运输蔗糖的进程。因此，高浓度的海藻糖会影响植物的生长发育。可见，海藻糖对植物的生理生化特性会产生一定的影响，并且能够维持逆境下植物的正常生长并提高产量。在植物中，海藻糖可以作为一种信号分子参与代谢，也可以作为代谢产物调控植物代谢和基因表达[23]。在外源海藻糖处理的母鳞片中，内源海藻糖的含量和TPS活性都显著高于对照，说明外源海藻糖可能通过增强TPS活性，促进内源海藻糖的形成，进而参与鳞片扦插过程的调节。

*表示对照和海藻糖处理处理之间的差异显著性；*表示0.05水平差异显著，**表示0.01水平差异显著。*Indicates the significance of the difference between the control and trehalose treatments；* Indicates a significant difference at the 0.05 level,** indicates a significant difference at the 0.01 level.图4 外源海藻糖对百合鳞片扦插过程中母鳞片淀粉、蔗糖和内源海藻糖代谢相关基因转录水平的影响Figure 4 The effect of exogenous trehalose on the transcription level of mother scale starch,sucrose,and endogenous trehalose metabolism-related genes during lily scale cutting

在百合的繁殖生长过程中，蔗糖对子鳞茎的形态建成起着非常重要的作用，而淀粉对子鳞茎的发生和发育至关重要[4]。有研究表明母鳞片的碳水化合物含量在鳞片扦插繁殖过程中会持续下降[9,24]。这与我们的结果一致。此外，研究发现外源海藻糖处理减缓了鳞片扦插繁殖中淀粉和蔗糖含量的下降。AGP被认为是植物体中淀粉合成需要的第一步关键酶[25]，SuSy的主要功能是分解蔗糖，可以调控蔗糖参与调节碳水化合物等代谢途径[26]。在百合鳞片扦插中，外源海藻糖处理的AGP活性显著高于对照，而SuSy活性相反，说明外源海藻糖可以提高AGP活性从而增加母鳞片中淀粉的含量，相反的，抑制SuSy活性从而减少了蔗糖的降解。这一结果与孙红梅等[24]在IBA与GA3调控百合鳞片扦插繁殖中的研究有差异。他们认为外源激素的施用促进了百合扦插鳞片中淀粉的快速降解、蔗糖合成。在转录水平中，外源海藻糖处理增加了淀粉合成相关基因SSS1、SBE和AGP1的相对表达量，而蔗糖代谢相关基因SuSy1和INV2的表达量相对于对照显著下降。这与淀粉和蔗糖相关酶活性的变化趋势一致。可溶性糖不仅作为光合作用的主要产物，也是碳水化合物代谢和能量暂时储存的主要形式[27]。本研究发现外源海藻糖处理下百合鳞片中可溶性糖含量在扦插生长后期呈增加趋势，这与孙汉青等[28]的研究结果相似，即干旱条件下施加外源ABA和海藻糖可以促进苹果果实中可溶性糖含量的增加。马光恕[29]也报道了不同浓度的海藻糖处理可以提高盐胁迫下甜瓜幼苗的可溶性糖含量和根系活力。

4 结论

本研究发现，50 mmol/L的外源海藻糖处理显著提高了扦插繁殖过程子鳞茎的数量，说明海藻糖对百合扦插繁殖具有促进作用。在百合鳞片的扦插繁殖过程中，母鳞片的碳水化合物含量持续下降，而外源海藻糖的施用显著减缓了这一损失。此外，外源海藻糖显著增加了淀粉合成相关酶活性及其基因表达，而蔗糖分解相关酶活性和基因的表达被显著抑制。最后，外源海藻糖增加了内源海藻糖的含量及其合成相关酶活性和基因的表达。可见，外源海藻糖可能是通过增加其内源糖合成和抑制糖降解来调节鳞片中的糖以及子鳞茎的发生。