甜橙 NHX 基因家族的鉴定及功能分析

杨杰 陈蓉 胡文娟 吴巧玲 佟晓楠 李兴涛 陈健美

摘要：Na+/H+逆向转运（Na+/H+exchange or antiporter，NHX）蛋白家族的氨基酸序列具有Na+/H+exchange 蛋白结构域，在植物生长发育和非生物胁迫应答中发挥重要作用。为探究甜橙（ Citrus sinensis ） NHX 基因家族的生物学特性，本研究从甜橙基因组中鉴定出6个 NHX 基因家族成员，并对其理化性质、基序组成、进化关系、表达谱等进行分析。结果显示， CsNHXs 编码蛋白的长度为407～543个氨基酸，分子量为44.71～59.97 ku;所有 CsNHXs 非均匀地分布在5条染色体上，均具有保守的Na+/H+exchange结构域;蛋白质二级结构分析结果表明，甜橙NHX蛋白主要以 α-螺旋和无规则卷曲为主。与拟南芥（ Arabidopsis thaliana ）、水稻（ Oryza sativa ）的NHX蛋白一起構建的系统进化树聚类为3个亚群，甜橙NHX蛋白分布在Endo和Vac亚群中。顺式作用元件预测分析结果表明， CsNHXs 启动子区域包含多个植物的生长发育响应元件、激素响应元件和逆境响应元件。转录组数据分析结果表明， CsNHXs 在甜橙不同组织中的表达存在差异性，总体上分为特异性表达和普遍性表达。本研究系统分析了甜橙 NHX 基因家族，为进一步阐明甜橙 NHX 基因家族的功能提供了理论依据。

关键词：甜橙; NHX 基因家族;生物信息学;基因表达;顺式作用元件

中图分类号：S666.401   文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2022）07-0035-08

收稿日期：2021-10-17

基金项目：国家自然科学基金（编号：32060667、32160731）;江西省教育厅科学技术研究项目（编号：GJJ190758、GJJ180758）。

作者简介：杨 杰（1995—），男，山西吕梁人，硕士研究生，主要从事果树逆境生理研究。E-mail：yangjiepersist@qq.com。

通信作者：陈健美，博士，副教授，主要从事柑橘遗传育种研究。E-mail：chen_jm09@hotmail.com。

Na+/H+逆向转运（Na+/H+exchange or antiporter，NHX）蛋白属于阳离子/质子逆向转运体1（cation/proton antiporter-1，CPA1）超家族，具有保守的Na+/H+exchange 结构域[1]。NHX蛋白能将细胞内Na+排除或区隔化来保持植物细胞内较低水平的Na+浓度[2]，具有调节细胞内pH值、控制细胞扩增和维持细胞膨压的功能，是响应植物抗旱耐盐机制的关键因子[3]。

NHX 基因广泛存在于植物中，现已在拟南芥[4]、水稻[5]、玉米[6]、苹果[7]、香蕉[8]等植物中发现了该基因家族蛋白。其中，部分 NHX 基因的功能也已经被验证。过表达AtNHX1的拟南芥株可以在200 mmol/L NaCl溶液中持续生长和发育[9];将水稻OsNHX1超表达，可以提高转基因水稻株的耐盐性[5];过表达SsNHX1的转基因玉米株在10 mg/mL NaCl溶液中有较高的种子发芽率和较小的生理损伤[10];刘威等通过施加10%聚乙二醇（PEG）6000、100 mmol/L脱落酸（ABA）提高了杜梨叶片中PbNHX1的转录水平[11];另外Bao等利用转基因技术将霸王ZxNHX1转入百脉根后，发现转基因株系的叶片和根中积累了比对照更多的Na+、K+和Ca2+，保持了其叶片较低渗透势和较高的保水率，显著提高了转基因株系的抗旱性[12]。

甜橙（ Citrus sinensis ）为芸香科（Rutaceae）柑橘属（ Citrus ）多年生果树，主要分布于16°～37°N，甜橙也是市场上畅销鲜果之一，我国是甜橙产量增长最快的国家[13-14]。 NHX 基因虽然已在多种植物中都有研究，但在甜橙中还未见关于 NHX 基因家族成员的报道。甜橙基因组数据的公布，使研究甜橙 NHX 基因家族成员成为了可能。本研究以甜橙为研究对象，在全基因组水平上鉴定出6个甜橙 NHX 基因家族成员，并进一步分析其理化性质、进化关系和表达水平等，以期为后续深入研究甜橙 NHX 基因的功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 甜橙 NHX 基因家族鉴定

甜橙基因组数据来源于CPBD（http：//citrus.hzau.edu.cn/index.php），含有Na+/H+exchange结构域的HMM模型（PF00999）来自于Pfam数据库（http：//pfam.xfam.org/）。利用HMMER 3.0软件在甜橙基因组数据中进行比对分析，比对结果经Pfam、CDD（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/term）和InterPro（https：//www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence/）数据库进行验证，去除不含Na+/H+exchange保守结构域的蛋白序列，得到的甜橙 NHX 基因家族成员（ CsNHXs ）按照其在染色体上的位置依次进行命名。

1.2 甜橙 NHX 基因编码蛋白的理化性质分析

利用ExPASy ProtParam软件（http：//web.expasy.org/compute_pi/）在线分析甜橙NHX蛋白序列长度、相对分子量、理论等电点、亲水性等理化性质;采用WoLF PSORT（https：//psort.hgc.jp/）进行亚细胞定位预测分析。

1.3 甜橙 NHX 基因家族成员的染色体定位及系统发育树构建

从CPBD获取甜橙基因组注释文件，确定 CsNHXs 的位置信息和染色体长度信息，利用Map MG2C工具（http：//mg2c.iask.in/mg2c_v2.0/）在线绘制 CsNHXs 在染色体上的位置分布图。

经查阅文献，分别得到8个拟南芥（ Arabidopsis thaliana ） NHX 基因序列号、7个水稻（ Oryza sativa ） NHX 基因序列号，参照前人的命名规则[15]对其命名。然后采用MEGA 7.0的Neighbor-Joining法构建系统发育进化树，Bootstrap值设置为1 000，其他参数为默认值。

1.4 甜橙 NHX 基因家族成员的基因结构与保守基序分析

使用GSDS v2.0软件（http：//gsds.gao-lab.org/）在线对 CsNHXs 的基因结构进行可视化分析;利用MEME在线网站（http：//meme-suite.org/）对 CsNHXs 编码的蛋白质进行模体（motif）分析，数量设置为10;通过Pfam数据库在线分析 CsNHXs 编码蛋白的保守结构域。

1.5 甜橙 NHX 基因编码蛋白的空间结构

甜橙NHX蛋白二级结构预测运用软件SPOMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）在线分析完成;通过SWISS-MODEL在线分析工具（https：//swissmodel.expasy.org/），采用同源建模（以序列相似度高的蛋白质结构为模板）的方法预测分析甜橙NHX蛋白的三级结构。

1.6 甜橙 NHX 基因家族成员的共线性分析

利用TB-tools分析 CsNHXs 在进化过程中可能发生的基因复制事件，并筛选重复基因对信息;根据蛋白序列的相似性，通过TB-tools绘制甜橙和枳（ Poncirus trifoliata）NHX 基因的共线性关系图。

1.7 甜橙 NHX 基因家族成员的启动子顺式作用元件分析

使用Plant CARE软件（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）预测 CsNHXs 起始密码子上游2 000 bp区域的顺式作用元件，并将顺式作用元件按照功能归类后通过 TB-tools 可视化。

1.8 甜橙 NHX 基因家族成员的表达分析

在CPBD数据库中下载甜橙愈伤组织、花、叶片和果实中的RNA-seq数据，分析 CsNHXs 在4个不同组织中的相对表达量。使用TB-tools将结果可视化，红色表示基因表达量上调，绿色则表示下调。

2 结果与分析

2.1 甜橙 NHX 基因家族成员的鉴定与分析

由表1可知，在甜橙基因组中共鉴定到6个 CsNHXs ，根据染色体定位依次命名为CsNHX1～CsNHX6。 CsNHXs 的蛋白序列差异较小，长度（以氨基酸数量计）为407～543个，蛋白质分子量为4471～59.97 ku。理论等电点（pI）介于5.16～894之间，其中CsNHX2和CsNHX6等电点大于7，为碱性蛋白;其余家族成员的等电点小于7，为酸性蛋白。蛋白亲水性平均系数为0.443～0566，均大于0，为疏水性蛋白。CsNHX1、CsNHX3和CsNHX4蛋白的不稳定系数均大于40，预测为不稳定蛋白;其他成员的小于40，为稳定蛋白。蛋白脂肪系数为101.97～112.60，平均值为109.59，均具有较高的脂肪系数。亚细胞定位预测结果表明，除CsNHX3定位在液泡，其他所有CsNHX蛋白都定位在质膜。

2.2 甜橙 NHX 基因家族成员的染色体定位分析

如图1所示，6个 CsNHXs 分别分布在5条染色体上。CsNHX1位于第2条染色体上，CsNHX2、CsNHX3位于第3条染色体上，CsNHX4位于第4条染色体上，CsNHX5位于第5条染色体上，CsNHX6位于第9条染色体上。总的来看，染色体的长度与其上分布的 CsNHXs 数量无正相关关系。

2.3 甜橙 NHX 基因家族成员的进化分析

采用Neighbor-Joining法构建拟南芥、水稻和甜橙共21个NHX蛋白序列的系统发育树，结果（图2）显示，供试 NHX 基因家族可以分为3个亚群，而甜橙 NHX 基因家族分为2个亚群。其中甜橙 NHX 基因家族成员主要集中于Vac亚群中，包括CsNHX2、CsNHX3、CsNHX4、CsNHX5和CsNHX6，而Endo亞群仅含CsNHX1。此外，PM亚群由拟南芥和水稻 NHX 基因所构成。

2.4 甜橙 NHX 基因家族成员的基因结构分析

分析6个甜橙 NHX 基因家族成员的基因结构，包括外显子、上下游序列及内含子。结果（图3）显示，6个 CsNHXs 均含有外显子，但各基因外显子数量存在差异。其中CsNHX1的外显子数量最多，达20个;CsNHX2、CsNHX4、CsNHX5和CsNHX6中均含14个外显子;CsNHX3最少，仅含10个。除CsNHX1和CsNHX3外，其余4个 CsNHXs 均含有上游基因序列。甜橙 NHX 基因家族成员分为2个亚群，且在进化树中位置相近的 CsNHXs 具有类似的基因结构。

2.5 甜橙 NHX 基因家族成员的保守基序分析

为进一步研究甜橙 NHX 基因家族成员结构特征，对6个 CsNHXs 的保守基序进行分析，得到10个保守motif（图4），其中motif的具体基序如图5所示。分析结果表明，不同 CsNHXs 的motif数量相差较大，为4～10个;所有 CsNHXs 均含有motif 1和motif 2，证明motif 1和motif 2基序高度保守，其中motif 2基序中包含FFI/LY/FLLPPI结合位点，代表Na+/H+exchange结构域;同一亚群 CsNHXs 间motif的数量、类型和空间分布相似，如motif 2、motif 4、motif 5、motif 6、motif 9和motif 10;CsNHX3中的Motif数量相比同一进化分支其他基因有缺失，这可能是基因串联重复过程中碱基丢失造成的;N端主要是motif 6，该基序保守结构可能与顺式作用元件结合。对CsNHX蛋白序列的结构域进行分析发现，所有CsNHX蛋白均含有Na+/H+exchange保守结构域（图6）。

2.6 甜橙NHX蛋白结构预测

甜橙NHX蛋白二级结构预测结果（表2）表明，6个CsNHX蛋白的二级结构均有α-螺旋、β-折叠和无规则卷曲。其中α-螺旋所占比例为4317%～50.38%，是甜橙NHX蛋白结构的主要组成部分;β-折叠和无规则卷曲所占比例较少，分别为360%～4.43%和29.73%～34.50%。用SWISS-MODEL在線分析CsNHX蛋白的三级结构，结果（图7）表明6个CsNHX蛋白之间的相似性在 27.46%～36.81%之间。

2.7 甜橙 NHX 基因家族成员的共线性分析

为了确定甜橙 NHX 基因家族成员的复制事件，对甜橙基因组进行共线性分析。结果（图8-A）表明，CsNHX5和CsNHX6之间存在共线性关系。为进一步阐明 NHX 基因在甜橙和枳之间的进化关系，对这2个物种进行共线性分析。如图8-B所示，在甜橙和枳之间共鉴定出7个直系同源基因对，分别为CsNHX1/Pt2g02470.1、CsNHX2/Pt5g016100.1、CsNHX3/Pt5g013790.1、CsNHX4/Pt1g015450.1、CsNHX5/Pt9g003290.1、CsNHX6/Pt9g003290.1和CsNHX6/Pt3g033270.1。

2.8 甜橙 NHX 基因家族成员的启动子顺式作用元件分析

在 CsNHXs 上游2 000 bp启动子区域的顺式作用元件类型主要分为3种：植物生长发育响应元件、激素响应元件、逆境响应元件（图9）。其中，参与植物生长发育的响应元件G-Box（30个）和Box 4（19个），存在于所有 CsNHXs 中。激素响应元件在 CsNHXs 中预测到8种，分布最广的脱落酸响应元件（ABRE）数量最多（26个）;其次是乙烯响应元件（ERE），数量为9个;而茉莉酸甲酯响应元件（TGACG-motif，CGTCA-motif）数量均为8个。逆境响应元件中，参与干旱诱导MYB结合位点（MBS）和非生物胁迫（W box）的元件数量均为6个，参与应激反应（TC-rich repeats）和厌氧诱导（ARE）的元件数量均为5个。这些结果表明， CsNHXs 在甜橙生长发育、激素诱导和响应非生物胁迫的过程中可能发挥重要作用。

2.9 甜橙 NHX 基因家族成员的表达分析

6个 CsNHXs 的表达模式结果表明， CsNHXs 在不同组织中均有不同程度的表达（图10）。其中，愈伤组织中表达量高的基因有CsNHX1、CsNHX2、CsNHX4和CsNHX6;花中表达量高的基因有CsNHX1和CsNHX2; 叶片中表达量高的基因为CsNHX2; 果实中表达量高的基因有CsNHX1、CsNHX2和CsNHX4。表明CsNHXs在甜橙中具有组织表达特异性。此外，CsNHX1和CsNHX2在不同组织中表达量均较高，而CsNHX3和CsNHX5表达量均较低。

3 讨论与结论

NHX蛋白主要参与植物响应盐胁迫过程中离子平衡的重建[16-17]，但对具有较高经济价值和营养价值的甜橙中 NHX 基因家族知之甚少。因此，对甜橙 NHX 基因家族的鉴定分析，有助于了解 CsNHXs 的结构和潜在功能。

本研究基于甜橙基因组数据共鉴定出6个 CsNHXs ，比拟南芥少2个，比水稻少1个，比番茄多1个[18]，说明不同物种间 NHX 基因家族成员数量存在差异。甜橙 NHX 基因家族成员间内含子-外显子分析结果差异较大， CsNXHs 内含子数量在9～19个，其中67%的 CsNHXs 含13个内含子;而外显子数量为10～20个。这与前人在葡萄[1]和石榴[19]中的研究结果相类似，证明 NHX 基因家族成员的基因结构在不同物种中比较保守。6个 CsNHXs 编码的蛋白均含Na+/H+exchange结构域，结构上高度保守，这与王影等对杜梨 NHX 基因家族的研究结果[20]一致。此外，4个CsNHX蛋白为酸性蛋白，推测 CsNHXs 主要在酸性亚细胞环境中发挥作用。

Wu等在甜菜 NHX 基因家族研究中将甜菜、拟南芥、水稻等13种植物共93个NHX蛋白的进化树聚成3个亚群：Vac、Endo和PM[15]。本研究中甜橙、拟南芥和水稻NHX蛋白的系统发育进化树同样分为Vac、Endo和PM共3个亚群， AtNHXs和OsNHXs 不均匀地存在于3个亚群中，而 CsNHXs 存在于除PM外的亚群中。相对单子叶植物水稻而言，甜橙与双子叶植物拟南芥 NHX 基因亲缘关系更近，同源性较高，说明 CsNHXs 在进化上较为保守。此外，具有相似Motif组成的甜橙 NHX 基因家族成员，在聚类分析中距离较近，暗示进化方式相近的 NHX 基因的蛋白结构和功能也相近。

6个 CsNHXs 启动子区含有多种激素类响应元件，且不同基因间元件数量和种类均有差异，说明 CsNHXs 响应激素的种类和程度不同，进而导致 CsNHXs间功能有差异;部分CsNHXs还同时含有多种逆境响应元件，证明CsNHXs 作为中间转录因子响应不同激素的信号，从而调节植株在逆境胁迫中的生长。罗建等对辣椒 NHX 基因启动子序列顺式作用元件的分析[21]与本研究的结果相似。此外， CsNHXs 在不同组织中表达的分析结果进一步表明，该基因家族在甜橙不同组织中存在表达差异，推测 CsNHXs 在甜橙愈伤组织、花、叶片和果实各自发育过程中发挥着一定的调控作用，但具体功能机制需要在后续试验中进一步验证。

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