UPLC-MS/MS同时测定经典名方泽泻汤中6个成分的含量

谭丽盈，胡国辉

广州中医药大学 第一附属医院，广东 广州 510400

泽泻汤为中药经典名方，出自东汉张仲景《金匮要略》，在2018年国家中医药管理局公布的《古代经典名方目录（第一批）》100 首中，其具有疗效确切、应用广泛的特点。泽泻汤原方记载：“泽泻五两，白术二两，右二味，以水二生，煮取一升，分温再服”，具有利水除饮、调补脾肾的功效[1-2]。方中泽泻为君药，白术为臣药，两者相须使用，共同发挥功效。目前，相关文献报道泽泻的主要成分为三萜类和倍半萜类，三萜类成分泽泻醇A、泽泻醇B、23-乙酰泽泻B是其主要的活性成分[3-5]。药理研究表明，泽泻的主要成分均具有降血压、调血脂、降血糖、利尿、抗炎的作用[2,6]。白术中的主要化学成分为白术内酯类、挥发类成分、苷类及多糖类成分[7]，白术中特有的活性成分主要是白术内酯类，其中白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅲ是白术中含量较高的成分，具有抗炎、抗菌、抗肿瘤、健补脾肾和调节胃肠道的作用[8-10]。目前，对泽泻汤的研究多为临床应用方法的报道[10-11]，质量控制方面的报道主要有高效液相色谱法（HPLC）测定泽泻汤中3 种或多种成分和泽泻汤的指纹图谱研究等[12-14]，未有其他质量控制手段的报道。质量控制仅通过对几个成分进行考察，缺少对全方的整体把握，超高效液相色谱串联三重四级杆质谱法（UPLC-MS/MS）是目前常用于中药复方中多成分含量测定的一种方法，具有灵敏度高、专属性强的优点。因此，本实验参考文献[15-16]，从泽泻和白术2味中药整体出发，建立UPLC-MS/MS同时测定泽泻汤中泽泻醇A、泽泻醇B、23-乙酰泽泻醇B、白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅲ含量的方法，为中药经典名方泽泻汤的质量控制提供参考。

1 材料

1.1 仪器

ACQUITY H-class 型超高效液相色谱仪、Xevo TQD 型三重四极杆质谱仪（美国Waters 公司）；QSM 型四元洗脱泵、FTN 型全自动进样器、BT124S 型电子天平（德国赛多利斯公司）；KG-300DE 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；Research plus型手动移液器（德国Eppendorf公司）。

1.2 试药

对照品泽泻醇A（批号：Must-19080105，纯度：99.49%）、泽泻醇B（批号：Must-19070305，纯度：99.38%）、白术内酯Ⅰ（批号：111975-201501，纯度：99.9%）、白术内酯Ⅱ（批号：111976-201501，纯度：99.9%）、白术内酯Ⅲ（批号：111978-201501，纯度：99.9%）、23-乙酰泽泻醇B（批号：111846-202006，纯度：98.3%）均购于中国食品药品检定研究院；乙腈为色谱纯；水为超纯水；其他试剂均为分析纯。

泽泻分别来源于福建（批号分别为190801、200502）、四川（批号：200901）；白术分别来源于安徽（批号：191203）、江西（批号：200101）和河北（批号：200702），经广州中医药大学第一附属医院梁文能副主任药师鉴定分别为泽泻科泽泻属植物泽泻Alisma plantago-aquaticaLinn.的干燥块茎厚片、菊科苍术属植物白术Atractylodes macrocephalaKoidz.的干燥根茎厚片，性状符合《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）2020年版标准。

采用随机组方的方法，将泽泻和白术进行组方，泽泻汤（实验室自制）批号分别为210501、210502、210503、210504、210505（表1）。

表1 泽泻汤及处方药材信息

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Agilent SB-C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），流动相：乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脱（0～3 min，28%A；3～5 min，28%～55%A；5～12 min，55%～75%A）；体积流量为0.3 mL·min-1；柱温为40 ℃；进样量为1 μL。

2.2 质谱条件

Waters Xevo TQD三重四极杆质谱仪，电喷雾离子源（ESI），正离子采集模式，采集方式为多反应监测（MRM），毛细管电压为3.0 kV，锥孔电压为40 V，脱溶剂气流速为400 L·h-1，脱溶剂气温度为800 ℃，空气为加热气，氩气为碰撞气，6个成分的质谱参数见表2。在上述色谱质谱条件下测定，对照品和供试品的色谱图见图1。

表2 泽泻汤中6个成分的质谱参数

图1 混合对照品和泽泻汤的MRM色谱图

2.3 对照品溶液的制备

精密称取白术内酯Ⅰ3.22 mg、白术内酯Ⅱ3.57 mg 和白术内酯Ⅲ4.06 mg 置25 mL 量瓶中，加甲醇溶解稀释至刻度，作为对照品储备溶液Ⅰ；精密称取泽泻醇A 4.12 mg、泽泻醇B 8.08 mg、23-乙酰泽泻醇B 7.36 mg置20 mL量瓶中，加甲醇溶解稀释至刻度，作为对照品储备溶液Ⅱ；分别精密吸取对照品储备溶液Ⅰ1 mL和对照品储备溶液Ⅱ2 mL置同一10 mL量瓶中，作为对照品溶液。

2.4 供试品溶液的制备

取泽泻80 g、白术32 g，加10倍量水，浸泡30 min，然后采用传统砂锅进行煎煮，煎煮1 h，滤过，滤液备用，然后加8倍量水，继续煎煮1 h，滤过，合并2次滤液，浓缩至100 mL，作为泽泻汤液，置冰箱中冷藏保存，精密吸取上述汤液1 g置10 mL量瓶中，加甲醇溶解稀释至刻度，摇匀，用0.22 μm 的微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.5 方法学考察

2.5.1线性关系的考察 精密吸取2.3 项下混合对照品溶液1 mL 置10 mL 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，作为对照品溶液，分别精密吸取20、100、200、500 μL 和1 mL 分别置10 mL 量瓶中，加甲醇溶解稀释至刻度，分别作为对照品1～5 号线性系列溶液，然后按照2.1、2.2 项下的色谱、质谱条件进行测定，以峰面积为纵坐标（Y），以进样量的质量浓度为横坐标（X）进行线性回归，结果见表3。

表3 泽泻汤6个成分的线性关系

2.5.2精密度试验 取2.3 项下对照品溶液，在2.1、2.2 项下色谱、质谱条件下，连续进样6 次，进行测定，结果泽泻醇A、泽泻醇B、23-乙酰泽泻醇B、白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ和白术内酯Ⅲ峰面积的RSD 分别为2.15%、2.87%、1.66%、1.09%、3.08%和3.36%，结果表明仪器的精密度良好。

2.5.3重复性试验 取上述泽泻汤溶液，分别精密吸取1 mL 置10 mL 量瓶中，共制备6 份样品，按2.4 项下的方法制备供试品溶液，按2.1、2.2 项下色谱、质谱条件进行测定，采用外标法计算，结果泽泻汤中泽泻醇A、泽泻醇B、23-乙酰泽泻醇B、白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ和白术内酯Ⅲ含量的RSD分别为0.69%、1.08%、1.97%、1.55%、2.32%和0.98%，结果表明该方法重复性良好。

2.5.4稳定性试验 取2.4 项下供试品溶液，分别在0、1、2、4、8、12、16、24 h测定，记录各色谱峰面积，结果泽泻醇A、泽泻醇B、23-乙酰泽泻醇B、白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ和白术内酯Ⅲ的峰面积的RSD 分别为3.52%、3.98%、2.77%、3.07%、2.66%和4.03%，结果表明该供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.5.5加样回收率试验 精密称取泽泻醇A 3.82 mg置5 mL 量瓶中，加甲醇溶解稀释至刻度，作为泽泻醇A对照储备溶液，精密称取泽泻醇B 3.92 mg、23-乙酰泽泻醇B 2.56 mg置同一10 mL量瓶中，精密吸取上述泽泻醇A 对照储备溶液1 mL，2.3 项下的白术内酯混合储备溶液1 mL，置上述10 mL 量瓶中，作为待加混合对照品溶液，精密吸取2.4 项下的泽泻汤0.5 g 置10 mL 量瓶中，共6 份，分别向上述6份样品的量瓶中各精密加入上述待加混合对照品溶液1 mL，加甲醇溶解稀释至刻度，作为供试品溶液，按照2.1、2.2 项下色谱、质谱条件进行测定，结果见表4。

表4 泽泻汤6个成分加样回收率试验结果

2.5.6样品含量测定 取自制的5 个不同批号的泽泻汤，然后分别按照2.4 项下方法制备，按照2.1、2.2项下色谱、质谱条件进行测定，外标法计算5批样品中泽泻醇A、泽泻醇B、23-乙酰泽泻醇B、白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ和白术内酯Ⅲ的含量，结果见表5。

表5 泽泻汤中6个成分含量测定结果

3 结果与讨论

3.1 指标成分的选择

泽泻醇A、泽泻醇B 和23-乙酰泽泻醇B 是泽泻发挥药效的主要活性成分，具有降血糖、调血脂和降血压的作用；白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ和白术内酯Ⅲ是白术药材质量控制的关键指标，具有抗炎、利尿和降血压的药理作用，白术在《中国药典》2020 年版中无含量测定指标成分，故通过测得3 个白术内酯的含量对其进行质量控制。本研究在测定中发现，泽泻汤在煎煮过程中23-乙酰泽泻醇B 不稳定，会发生氧环开裂并重排，生成24-乙酰泽泻醇A，进而脱乙酰基转换为泽泻醇A 和泽泻醇B，因此，对于泽泻的质量控制建议控制3 个成分之和，白术内酯的3 个成分含量较低，尤其白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅲ不稳定，易发生分子脱水生成白术内酯Ⅱ，白术内酯Ⅲ和白术内酯Ⅰ可以发生分子间脱水生成双白术内酯，因此，对于白术质量的控制也应该控制3 个白术内酯之和，比单一控制某个成分更具有实际意义。

3.2 色谱、质谱条件的选择

本研究首先对甲醇和乙腈分别与0.1%甲酸水溶液作为流动相进行考察，结果发现以甲醇-0.1%甲酸水溶液为流动相时，白术内酯的3 个成分色谱峰形不好，响应较低，当以乙腈-0.1%甲酸水溶液为流动相时，泽泻汤中6 个成分的色谱峰均可较好分离，响应值较高。然后对6 个成分分别在正、负离子模式下进行扫描，结果发现，正离子模式下所有成分的响应优于负离子，因此，在正离子模式下分别对6 个成分的锥孔电压、毛细管电压、碰撞能量和碰撞电压等质谱参数进行优化，选择强度最高、稳定性和重复性较好的离子作为定量离子进行定量分析，最终确定本实验的质谱采集条件。

3.3 结果的分析

本实验对经典名方泽泻汤中6个主要成分进行测定，将其作为质量控制方法，5批样品中泽泻醇A、泽泻醇B、23-乙酰泽泻醇B、白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ和白术内酯Ⅲ的平均质量浓度分别为158.66、754.17、557.11、24.71、32.91、20.12 μg·mL-1，质量分数为148.32～170.06、689.79～810.66、488.13～628.35、12.58～20.33、29.67～36.18、17.51～24.34 μg·g-1，含量波动均在平均值的70%～130%，符合《古代经典名方中药复方制剂物质基准的申报资料要求（征求意见稿）》的要求。本实验由于所制样品批数较少，药材的产地信息偏少，只是对2 个不同产地的泽泻和3 个不同产地的白术进行随机组方，制备泽泻汤，具有一定的局限性。从结果可以看出，不同产地泽泻与不同产地的白术组合时，泽泻汤中6 个成分的含量存在一定的差异，因此，在泽泻汤的组方中可以考虑药材的产地信息，同时结合临床药效结果，优选泽泻汤的最佳产地组方，从而保证泽泻汤的质量和临床疗效。

4 结语

本实验建立了UPLC-MS/MS 同时测定经典名方泽泻汤中泽泻醇A、泽泻醇B、23-乙酰泽泻醇B、白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ和白术内酯Ⅲ含量的方法，通过同时测定多种成分来控制处方中泽泻和白术药材的质量，并对测定结果进行分析评价，且UPLCMS/MS 具有分析速度快、灵敏度高、专属性强的优点，更适合于中药经典名方的开发及复方制剂中多成分的含量测定，但是对于泽泻汤物质基础中活性成分的研究仍然需要借助超高效液相色谱串联飞行时间质谱进行深入分析，从而阐明更多泽泻汤的物质基础，在发现确定活性化学成分的基础上建立质量控制标准，保证泽泻汤的疗效，从而更好地为经典名方泽泻汤及其相关制剂的后续开发提供参考。