基于网络药理学和分子对接的痰热清干预耐药铜绿假单胞菌致呼吸系统感染作用机制研究△

吴娅丽，王晓艳，2，张辉，陈毓龙，张明亮，张书琦，陈小菲，李伟霞，2*，唐进法，2*

1.河南中医药大学 第一附属医院 河南省中药临床应用、评价与转化工程研究中心/河南省中药临床药学中医药重点实验室，河南 郑州 450000；2.河南中医药大学 呼吸疾病中医药防治省部共建协同创新中心，河南 郑州 450000；3.河南中医药大学，河南 郑州 450046

中国细菌耐药检测网（CHINET）发布的《2020年细菌耐药监测结果（全年）》[1]显示，来自全国54 家医院的251 135 株临床分离菌株中，铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）位于主要菌种分布第4 位（占8.42%）；且在90 955 株呼吸道标本分离菌株中位于第3 位（占14.30%），故PA 为引起呼吸道感染的重要致病菌之一。PA 自身多种适应机制及抗菌药物不合理使用诱使PA 通过不同的机制产生耐药[2-3]，使临床抗感染治疗难度骤增。本课题组前期采用回顾性分析方法对河南中医药大学第一附属医院2018－2021 年分离鉴定的来自187 名患者的608 例耐碳青霉烯铜绿假单胞菌（carbapenem resistant PA，CRPA）进行统计和分析，显示CRPA患者的中医临床辨证以痰热壅肺证（27.03%）及风温肺热证（16.22%）为主；治疗过程基本用药中，联合使用中药注射剂以醒脑静、痰热清、血必净等为主。其中痰热清具有清热、化痰、解毒等作用，主要用于肺炎早期、急性支气管炎、慢性支气管炎急性发作、呼吸道感染等疾病，具有广谱抗菌杀毒作用，在临床大量使用[4]。且已有临床数据证实其能够有效治疗下呼吸道耐药PA 感染[5]，且能够下调细菌外排泵基因表达，使细菌耐药性减弱，降低抗生素临床使用剂量，起到抑菌作用[6]。但痰热清治疗耐药PA感染的物质基础和作用机制均尚不明确。

鉴于中药复方成分的多样性及其与机体作用的多靶点、多通路等复杂性，本研究基于网络药理学方法探究痰热清干预耐药PA 感染的物质基础及作用机制，并采用分子对接方法初步验证，为临床应用提供参考，并为进一步研究提供方向。

1 材料与方法

1.1 痰热清相关靶点筛选

痰热清由黄芩、熊胆粉、山羊角、金银花、连翘提取而成，以5 味药为关键词，分别在中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php）[7]中查找所收录化学成分，根据口服生物利用度（OB）≥30%且类药性（DL）≥0.18 进行活性成分初步筛选。基于SwissADME[8]平台（http://www.swissadme.ch/），设定肠胃吸收（GIabsorption）为“High”，并根据Lipinski类药性五原则选择满足其中2项标准的化合物，即为各味中药潜在活性成分，并根据文献报道予以补充[9-19]。通过化源网（https://www.chemsrc.com/）及PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）数据库获取各活性成分的结构式，导入SwissTargetPrediction平台（http://www.swisstargetprediction.ch/）[20]，以“homo sapiens”为选择物种，预测各活性成分的潜在作用靶点。

1.2 PA 相关呼吸系统疾病及临床一线用药靶点筛选

以“chronic obstructive pulmonary disease”“acute/chronic bronchitis”“acute/chronic pneumonia”“lower respiratory tract infection”“pulmonary infection”等与PA 相关的呼吸系统疾病为关键词，挖掘OMIM 数据库（http://www.omim.org）中的潜在靶点；参考《广泛耐药革兰阴性菌感染的实验诊断、抗菌治疗及医院感染控制：中国专家共识》[21]和美国《医院获得性肺炎治疗指南（2005）》[22]，选取头孢他啶、头孢哌酮、头孢哌酮-舒巴坦、美罗培南、氨曲南、阿洛西林6 种抗生素，通过PubChem 数据库获取结构式，导入SwissTargetPrediction 平台预测潜在靶点，并查阅文献予以补充。合并两者靶点，为PA 相关呼吸系统疾病及临床一线用药相关靶点（以下简称疾病靶点）。

1.3 蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络构建

为明确痰热清相关靶点与疾病靶点间的相互作用，将1.1 及1.2 项下所获取相关靶点导入Venny 2.1.0 数据库获取两者交集靶点，将交集靶点导入STRING 11.0 数据库（https://string-db.org/）构 建PPI 网络，以“homo sapiens”为选择物种，最小互作阈值设定为“highest confidence（＞0.9）”，其余为默认设置；并通过Cytoscape 3.8.0 软件中的MCODE插件对PPI网络进一步分析。

1.4 网络构建及共同靶点的功能与通路富集分析

将痰热清成分与疾病的共有靶点导入Cytoscape 3.8.0 软件，建立化合物-疾病-靶点网络，利用软件内置工具分析有效成分及靶点的网络拓扑参数，包括度（degree）、介度（betweennesss centrality）及紧密度（closenessss centrality）等；并将共有靶点导入Metascape 平台[23]，设置P＜0.01，进行基因本体（GO）富集分析及京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析，然后使用OmicShare Tools（https://www.omicshare.com/tools）制作通路高级气泡图；采用Cytoscape 3.8.0 软件构建成分-靶点-通路网络。

1.5 分子对接验证痰热清潜在活性成分与靶标的结合作用

基于1.3 项下PPI 网络及1.4 项下所构建网络选取核心靶点及主要活性成分，登录PubChem 数据库下载主要活性成分结构并保存为.sdf 格式，利用ChemDraw 3D 软件转换为.mol2 格式，AutoDock Tools 1.5.6 软件打开配体小分子并进行加氢及电荷等操作，保存为.pdbqt 格式文件；登录PDB 蛋白质数据库[24]，参照目标蛋白的筛选标准（来源物种：homo sapiens；细化分辨率≤3.0；发布日期：近10年；优先考虑含有与活性成分相似的配体）分别下载核心靶点的蛋白晶体结构，在AutoDockTools

1.5.6中打开，加上氢原子等操作使其处于合理的构象，将其定义为受体并保存成.pdbqt 文件；根据配体位置确定Vina 分子对接的坐标和盒子大小，参数exhaustiveness设置为20以增加计算准确度；采用AutoDock vina 1.1.2 进行半柔性对接，选取affinity最佳的构象作为最终对接构象；最后选取对接结合能量最低的构象分析对接结合模式，采用Discovery studio 4.5.0对对接结果进行可视化处理。

2 结果

2.1 痰热清活性成分及靶点筛选

通过TCMSP初步提取黄芩、金银花、连翘、山羊角和熊胆粉化学成分分别为36、23、23、13、3个，经检索文献补充及SwissADME平台筛选后共获得黄芩、金银花、连翘、山羊角、熊胆粉的化学成分分别为32、31、28、13、3 个。SwissTargetPrediction平台预测5 味中药活性成分的作用靶点分别为362、377、502、81、57 个，合并靶点并删除重复值得到痰热清活性成分作用靶点共746个。

2.2 疾病靶点筛选

通过OMIM 数据库获得慢性阻塞性肺疾病（COPD）靶点200 个、急性支气管炎及急性肺炎靶点各167 个、慢性支气管炎靶点及慢性肺炎靶点各80个、下呼吸道感染靶点188个、肺部感染靶点301个，通过SwissTargetPrediction 数据库共预测临床一线用药靶点258 个，合并各疾病相关靶点及临床一线用药靶点并删除重复值，共得到疾病靶点959个。

2.3 痰热清成分-疾病靶点PPI网络的构建

将筛选所得痰热清活性成分靶点与疾病靶点取交集，采用Venny 2.1.0 平台获取两者的共有靶点213个（图1）。采用STRING 11.0平台分析共有靶点，选取度值较高的前30 个靶点构建PPI 网络（图2A）；结合Cytoscape 3.8.0 软件中的MCODE 插件得到其内在模块（module，图2B），度值越高表明该靶点作用越关键。度值较高的核心靶点有磷脂酰肌醇4,5-二磷酸3-激酶亚基（PIK3CA，度值为20）、信号传导子及转录激活子3（STAT3，度值为18）、原癌基因酪氨酸受体激酶（SRC，度值为18)、表皮生长因子受体（EGFR，度值为17）、酪氨酸蛋白激酶（JAK2，度值为16）等；MCODE 插件分析可知得分（Score）较高的靶点包括SRC（6.53）、STAT3（5.50）、EGFR（4.00）、PIK3CA（3.24）等。

图1 痰热清成分-铜绿假单胞菌相关呼吸系统疾病及一线用药相关靶点的韦恩图

图2 痰热清成分-疾病主要靶点的PPI网络及网络中的模块

2.4 痰热清成分-疾病-靶点网络的构建

将痰热清成分与疾病靶点的213 个共有靶点导入Cytoscape 3.8.0 软件构建痰热清成分-疾病-靶点的核心网络（图3），并通过内置工具分析拓扑参数（表1）。

表1 痰热清成分-疾病-靶点网络节点特征参数

图3 痰热清成分-疾病-靶点网络

由结果可知，痰热清活性成分的介度、紧密度、度均值分别为0.006、0.427、21，PA 相关疾病及临床一线用药的介度、紧密度、度均值分别为0.005、0.377、11，靶标的介度、紧密度、度均值分别为0.013、0.434、31。痰热清中黄芩活性成分度值最高（平均度值为34），其次为金银花和连翘中的活性成分（平均度值分别为18 和12）。活性成分中度值较高的包括粘毛黄芩素Ⅲ、榄核莲黄酮、木犀草素、汉黄芩素、山柰酚、槲皮苷、金圣草黄素、异鼠李素、黄芩新素、水杨苷、黄芩黄酮、rivularin等。关键靶标主要包括碳酸酐酶（CA2、CA1、CA9、CA7、CA4 等）、基质金属蛋白酶（MMP13、MMP2、MMP12、MMP9 等）、EGFR、糖原合成酶激酶-3β（GSK3B）、磷脂酰肌醇4,5-二磷酸3-激酶催化亚基γ亚型（PIK3CG）等。

2.5 生物功能富集及通路分析

应用Metascape数据平台对痰热清干预铜绿假单胞菌感染的相关靶点进行生物功能富集，并对相关靶点进行信号通路分析。由结果可见，多个靶点的功能与痰热清干预PA感染密不可分（图4）。痰热清主要参与的生物学过程（BP）包括对MAPK通路的调节（regulation of MAPK cascade）、对氮化合物的应答（cellular response to nitrogen compound）、对无机物的应答（response to inorganic substance）、化学突触传递的调节（modulation of chemical synaptic transmission）等（图4A）；在分子功能（MF）层面上，主要与碳酸脱水酶活性、磷酸转移酶活性、G 蛋白偶联受体、金属内肽酶活力、热休克蛋白等有关（图4B）；在细胞组分（CC）方面，主要作用于树突、膜筏、囊腔、核周质等（图4C）。

图4 痰热清成分-疾病共有靶点GO富集分析

通过Metascape数据平台对KEGG通路进行富集分析，发现具有显著相关的通路有135条（P＜0.05），通过检索筛选出23 条与痰热清干预PA 感染相关的核心通路（图5），主要涉及缺氧诱导因子-1（HIF-1）信号通路、磷脂腺肌醇3-激酶-蛋白激酶B（PI3KAkt）信号通路、黏着斑、Ras 信号通路、EGFR 酪氨酸激酶抑制剂耐药性信号通路、MAPK信号通路、JAK-STAT信号通路、趋化因子信号通路等。

图5 痰热清成分-疾病共有靶点KEGG通路富集分析

运用Cytoscape 3.8.0软件构建痰热清成分-疾病靶点-通路网络（图6），并对核心成分及核心作用靶点预测分析，预测ADORA1、MMP13、GSK3B、MMP2、EGFR、SRC、PIK3CG、PIK3CA、MAPK1、TNF等为痰热清干预PA 感染的重要靶点；黄芩中的表小檗碱、榄核莲黄酮、水杨苷、黄烷酮、汉黄芩素、黄芩新素、黄芩素、金合欢素、黄芩黄酮、去甲汉黄芩素、粘毛黄芩素Ⅲ等，金银花中的山柰酚、木犀草素、槲皮苷、金圣草黄素、异鼠李素、异绿原酸C、异绿原酸B 等，连翘中的表桉叶明、安五脂素、连翘脂素、远志酮等为痰热清干预PA 感染的主要成分。

2.6 分子对接验证

基于2.3 项下核心PPI 网络及2.4 项下成分-疾病-靶点网络，筛选出既与多种主要活性成分相连，又在PPI 网络中具较高MCODE Score 和连接度的靶点，包括EGFR（与26 个成分相连，Score=4）、SRC（与21 个成分相连，Score=6.53）、黏着斑激酶2（PTK2，与8 个成分相连，Score=3）、PIK3CA（与7 个成分相连，Score=3.24）、MAPK1（与6 个成分相连，Score=5.2）、蛋白酪氨酸激酶2（JAK2，与4 个成分相连，Score=4）。采用分子对接法考察6个靶标蛋白与潜在活性成分间的结合能力，结果显示，潜在活性成分与靶标蛋白的结合能均小于-17 kJ·mol-1，说明受体与配体间具潜在的结合活性及低结合能量的稳定性。因此，推测所选取化合物为痰热清治疗铜绿假单胞菌感染相关呼吸系统疾病的主要活性成分，其中，其他5 种靶标蛋白较MAPK1 与活性成分的结合活性较佳（图7）。最后，选取对接结合能量最低的构象用于分析对接结合模型，并通过Discovery Studio 4.5.0 软件对其2D 和3D模型进行可视化处理（图8）。

图7 痰热清活性成分与6个核心靶标蛋白的分子对接结合能热图

图8 痰热清活性成分与6个核心靶标蛋白的分子对接作用方式

3 讨论

PA 具有易定植、易变异、多耐药等特点，多致肺部感染，是临床最常见的医院获得性感染重要的条件致病菌，且为多重耐药和广泛耐药致病菌之一，故临床可选择的敏感性药物非常有限、治疗难度较大[25]。中医学中虽并无重症肺炎的具体病名，但可归于“风温犯肺”范畴；临床上重症肺炎常见痰热壅肺证、痰湿阻肺证、热陷心包证、邪陷正脱证4种证型，单存相兼并见[26-27]。对于感染，中医从细菌与患者2 方面认识，认为“正气存内则邪不可干”，内因是根本，不是单纯的抗菌；中药复方的抗菌作用也不是单一的抑制或杀灭细菌，而是抗菌、免疫调节、消除细菌耐药性等途径的多方位组合作用，且已有案例表明中医药对大型爆发性呼吸道感染性疾病[如重症急性呼吸综合征（SARS）、获得性肺炎等]有重要的预防和治疗作用[28]。

本课题组前期回顾性分析河南中医药大学第一附属医院3年间CRPA患者的基本信息及临床治疗过程用药，统计发现CRPA 患者的中医临床辨证以痰热壅肺证及风温肺热证为主，故临床诊治过程中可佐以清热解毒类中药。痰热清具有清热、化痰、解毒等作用，主疾热阻肺证，逐渐成为治疗感染性疾病的新方向[29]。

痰热清注射液中黄芩为君药，熊胆粉、山羊角为臣药，金银花为佐药，连翘为使药[30]。本研究通过网络药理学方法初步筛选出痰热清干预耐药铜绿假单胞菌所致肺部感染的活性成分为汉黄芩素、山柰酚、槲皮素、木犀草素、黄烷酮、黄芩素、黄芩苷、异鼠李素、异绿原酸C、连翘脂素、安五脂素等；5 味中药中黄芩活性成分平均度值最高，且主要活性成分多来自于黄芩，体现其君药合理性；但熊胆粉和山羊角活性成分平均度值较低，或因山羊角的氨基酸类成分主要为内源性成分，熊胆粉主要成分为胆酸类[31]，其作用靶点研究相对较少。

PA 所致肺部感染过程复杂，首先大量PA 通过鞭毛、菌丝、细胞膜表面脂多糖（LPS）聚集黏附于呼吸道上皮细胞，继而通过分泌蛋白、群体感应系统、绿脓菌素和LPS 等因子侵袭激活宿主免疫应答，产生细胞因子、趋化因子等炎性介质，募集并激活巨噬细胞、中性粒细胞、T 细胞，最终导致严重肺损伤[28,32]。根据PPI核心网络及痰热清成分-疾病靶点-通路网络分析，发现痰热清干预耐药PA 感染的靶点主要为EGFR、SRC、PIK3CA、MAPK1、PIK3CB、PTK2、MAPK8、MAPK14、JAK2、STAT1等，主要涉及HIF-1、PI3K-Akt、黏着斑、Ras、EGFR 酪氨酸激酶抑制剂耐药性、MAPK、JAKSTAT、趋化因子等信号通路。其中PI3K-Akt和Ras/MAPK 是细胞膜表面受体信号转导的重要通路，涉及炎症和免疫应答过程[28]。炎性因子或其他生长因子可通过与膜上受体结合或激活JAK 进一步激活PI3K 和MAPK 以调节细胞增殖、分化、表达促炎因子[33]。细菌可通过EGFR-MAPK 信号通路增加低聚黏液/凝胶的产生，EGFR 抑制剂可通过抑制MAPK3、MAPK1 和MAPK14 磷酸化而抑制病原菌所致呼吸道粘液的过度产生[34]。通过分子对接发现，所选20个活性成分与EGFR、SRC、PTK2、PIK3CA、MAPK1、JAK2 间均具较好直接作用，故推测痰热清主要通过作用于以上6 种靶蛋白抑制PI3K-Akt 和EGFR-MAPK 信号通路，进而抑制耐药PA 在呼吸道过度黏附、产生黏液并分泌炎性因子和内毒素，从而缓解呼吸系统疾病。

综上所述，本研究通过网络药理学分析和分子对接验证，发现痰热清注射液干预耐药PA 感染是多成分、多靶点、多通路的综合作用，提示网络药理学可全面、系统研究中药复方，体现中医整体性；该研究也为痰热清临床干预耐药PA 感染提供依据，并为进一步机制研究提供参考。