HPLC法测定康骨宁颗粒中橙皮苷的含量*

唐莉华 黄学娣 熊 跃 黄 宽 李 凡

在外力作用下，破坏了骨或软骨的完整性和连续性者，称为骨折，属于中医“骨伤”范畴。由于外因(直接外力、间接外力、撕脱暴力、累积性力)和内因(解剖结构、年龄、病理因素、职业因素)等病因，可造成开放性和闭合性骨折。临床主要症状为局部疼痛、肿胀和功能障碍(握持、站立、行走等功能的丧失)[1]。清代沈金鳌在《杂病源流犀烛》中指出：“凡人忽跌忽闪挫，必气为之震，震则激，激则壅，壅则气凝聚一处……气运乎血，血本随气以周流，气凝则血亦凝矣……气滞血瘀，则作肿作痛，诸变百出……故跌扑闪挫，其伤在外而病必及内，其气必壅，其血必凝……为之行气，为之行血，不得徒从外涂抹之已也……轻者，顿挫气血，凝滞作痛，当导气行血而已。若重者，伤筋折骨，必须接续”[2]。康骨宁颗粒由龙血竭、当归、川芎、陈皮、生地黄、赤芍、乳香、没药、续断、骨碎补等中药组方而成，具有活血祛瘀、行气止痛、消肿生肌、接骨续筋等作用[3-5]。此成药方由江西省中西医结合医院骨科谢水华主任医师根据沈金鳌的“接骨紫金丹”(载于《杂病源流犀烛》)，结合自身多年临床经验化裁而成，在治疗四肢骨折疾病方面，具有独特的疗效。在保证疗效的前提下，该药已经进行了制剂工艺的研究，但还未建立指标性成分的质量控制标准。为了弥补康骨宁颗粒的不足之处，此研究参考《中华人民共和国药典》[6]与文献研究[7，8]中关于橙皮苷含量测定的方法，应用HPLC法测定康骨宁颗粒中橙皮苷的含量，为制定康骨宁颗粒的质量控制标准，提供科学的实验依据。以保障临床应用的安全性、有效性和制剂的质量可控性，从而进一步提高临床的疗效及治愈率。

1 材料

1.1 仪器高效液相色谱仪、自动进样器、紫外检测器(Agilent 1260)；电子分析天平(ESJ182-4，沈阳龙腾电子有限公司)；恒温干燥箱(202-2-S，上海跃进医疗器械厂)；超声波清洗机(KQ2200B，昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 药物与试剂康骨宁颗粒(批号：20200701-20200710，自制)，对照品橙皮苷(批号：110721-202019，中国食品药品检定研究院)，乙腈为色谱纯试剂(赛诺菲世尔科技(中国)有限公司)，水为自制超纯水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件色谱柱：安捷伦C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：以乙腈为流动相A，以水(用磷酸调节pH值为3)为流动相B，按照表1程序进行梯度洗脱。流速：1.0 ml·min-1，柱温：30 ℃ ，检测波长：283 nm；进样量：10 μl，理论板数按橙皮苷峰计算应不低于2000。见表1。

表1 梯度洗脱程序

2.2 对照品溶液的制备取橙皮苷对照品适量，精密称定，加入80%甲醇(体积分数为80%的甲醇水溶液，以下相同)溶解，并稀释制成每1 ml含橙皮苷25 μg的溶液，即得对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备取康骨宁颗粒适量，研细(过4号筛)并混匀，取约1 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中。精密加入25 ml的80%甲醇溶液，密塞，称定重量，超声处理30 min(功率300 W，频率40 kHz)，取出后放冷，再称定重量。用80%甲醇溶液补足减失的重量，摇匀并滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2.4 阴性对照品溶液的制备按康骨宁颗粒原处方比例称取缺陈皮的中药饮片，按照其制剂工艺制备阴性样品，再按照“2.3”项下的供试品溶液的制备方法制备，即得阴性对照品溶液。

2.5 专属性试验分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液以及缺陈皮阴性对照溶液各10 μl，按照“2.1”项下色谱条件分别进行测定，记录色谱图，结果见图1。试验结果表明，供试品溶液色谱(图1B)中与对照品色谱(图1A)中在相同的保留时间(橙皮苷保留时间约10 min)有对应的色谱峰，理论塔板数符合要求，并与其他各峰达到基线分离，阴性样品色谱(图1C)中在相同保留时间(10 min)无对应的色谱峰。表明本方法专属性良好，阴性对照色谱不干扰测定。

注：橙皮苷对照品(A)、康骨宁颗粒供试品(B)和缺陈皮阴性样品(C)。图1 色谱图

2.6 方法学考察

2.6.1 线性关系考察分别精密吸取对照品溶液(橙皮苷浓度为26.13 μg·ml-1)2 μl、5 μl、8 μl、10 μl、15 μl、20 μl注入高效液相色谱仪中，按照“2.1”项下色谱条件进行测定，记录峰面积。并以橙皮苷的进样量作为横坐标(X)，以峰面积作为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，进行线性回归，得到回归方程为Y=0.9148X+4.5012，R=0.9998。试验数据结果表明，橙皮苷的进样量在52.26～522.60 ng范围内，与峰面积呈良好的线性关系。

2.6.2 精密度试验精密吸取橙皮苷的对照品溶液，按照“2.1”项下色谱条件，分别重复进样6次进行测定，并记录峰面积，计算其相对标准偏差为0.18%。试验数据结果表明，仪器的精密度良好，能满足含量测定的要求。

2.6.3 重复性试验取康骨宁颗粒(批号：20200701)6份，每份约1 g，按照“2.3”项下的方法平行制备6份供试品溶液，按照“2.1”项下的色谱条件进行测定，计算橙皮苷平均含量为0.64 mg/g，其相对标准偏差为0.73%。试验数据结果表明，该测定方法的重复性良好。

2.6.4 稳定性实验取康骨宁颗粒(批号：20200701)约1 g，按照“2.3”项下的方法制备供试品溶液，于室温放置0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、18 h、24 h时，精密各吸取10 μl供试品溶液，按照“2.1”项下的色谱条件进行测定，记录峰面积，计算相对标准偏差为1.67%。试验数据结果表明，供试品溶液在室温条件下放置24 h以内，其稳定性良好。

2.6.5 加样回收率试验取康骨宁颗粒(批号：20200701，每1 g含橙皮苷0.64 mg)6份，精密各称定0.50 g，分别加入橙皮苷对照品溶液1 ml(每1 ml含橙皮苷0.3179 mg)，按照“2.3”项下的制备方法，制成加样回收样品溶液，再按照“2.1”项下的色谱条件测定，记录峰面积，计算加样回收率的平均值为100.28%，其相对标准偏差为0.50%。试验数据结果表明，该方法准确度良好。见表2。

表2 加样回收率试验结果

2.7 样品的测定取10批康骨宁颗粒各约1 g，按照“2.3”项下的方法制备样品溶液，再按照“2.1”项下的色谱条件进行测定，记录峰面积，计算康骨宁颗粒中橙皮苷的平均含量为8.24 mg/袋。见表3。

表3 康骨宁颗粒中橙皮苷的含量测定结果

3 讨论

3.1 指标性成分的选择康骨宁颗粒由13味中药组成，君药龙血竭来源于百合科乔木植物剑叶龙血树(Dracaenacochinchinensis(Lour.)S.C.Chen)的含脂木材经提取得到的树脂，具有良好的活血散瘀、定痛止血和敛疮生肌的作用[9]，素有“活血之圣药”的美誉。现代药理研究[10,11]显示龙血竭能明显缩短小鼠凝血时间和家兔血浆复钙时间，广泛应用于跌打损伤、外伤出血等，可作为血竭的国产替代品。多省市颁布的中药饮片炮制规范[9,12，13]中以龙血素B作为含量测定的成分，均使用三氯甲烷(非极性溶剂)作为成分提取溶剂。通过查阅相关研究资料[10，14-16]，仅对龙血竭的脂溶性成分(黄酮类、木质素、皂苷类、甾醇类、酚类等)有相关研究。结合康骨宁颗粒的制备工艺，龙血竭脂溶性成分不适宜作为康骨宁颗粒的指标性成分。臣药当归中的水溶性阿魏酸与佐药川芎的阿魏酸经过试验，存在阴性干扰。笔者对处方中其他药材进行了研究，参考《中华人民共和国药典》[6]和文献报道[17]选择了行气药陈皮中橙皮苷为指标性成分，建立了橙皮苷的含量测定方法。

3.2 样品提取方法的选择根据文献报道[17，18]、橙皮苷的溶解性以及康骨宁颗粒的制备工艺等因素，对样品中指标性成分橙皮苷提取溶剂的浓度(50%甲醇、70%甲醇、80%甲醇、90%甲醇)、用量(25 ml、50 ml、75 ml、100 ml)和超声提取时间(0.5 h、1 h、1.5 h、2 h)进行了考察与择优选择。最终确定采用80%乙醇溶液25 ml进行提取，超声处理30 min为提取的条件。应用该方法处理后的样品，橙皮苷成分提取完全、提取率高，溶剂的用量处于最优化，室温下含橙皮苷的供试品溶液24 h内稳定性良好。

3.3 橙皮苷含量限定的确定据《中华人民共和国药典》[6]陈皮项下规定：水分不得过13.0%，干燥品含橙皮苷(C28H34O15)不得少于2.5%。康骨宁颗粒每袋中含有陈皮为1.44 g，在充分考虑大生产环节中的药材损耗等因素，橙皮苷的转移率以12%为标准(制剂工艺研究橙皮苷转移率为15%)，得出本品每袋含橙皮苷为3.76 mg。故拟将康骨宁颗粒的含量限度定为：每袋含陈皮的剂量，以橙皮苷(C28H34O15)计，不得少于3.8 mg。

此试验以橙皮苷为指标性成分，利用HPLC法测定陈皮中橙皮苷的含量测定，并初步设定含量限定的标准。该方法样品制备方法简便，测量方法专属性好，阴性无干扰，定量分析方法的精密度、重复性、稳定性、准确度良好，可有效地控制该药品的内在质量，为康骨宁颗粒的质量控制及质量标准的制定提供了科学依据。