HPLC 法同时测定不同来源红曲中腺苷等3 个成分的含量*

高文铭，林跃松，戴国梁，赵林钢**

1 南京市六合区中医院，南京 211505；2 南京中医药大学附属医院，南京 210029

红曲是一种药、食两用的传统物质，性温、味甘，具有活血化瘀、健脾消食之功效，临床主治高脂血症、产后恶露不净、动脉粥样硬化、瘀滞腹痛等症[1]。

曲霉科真菌紫色红曲菌Monascus purpureus Went 的菌丝及孢子在粳米内部生长，使整个米粒变成红色，即为红曲[2]。现代药理研究表明，红曲具有降血脂、降血压、抗肿瘤等作用[1，2]。他汀同系物及核苷类成分是红曲中的主要活性成分[3]。

目前，红曲现有的质量标准主要以洛伐他汀的含量作为参考[4]。此外，核苷类成分亦具有多种生物学活性，参与DNA 代谢过程，并具有抗肿瘤、抗炎、抗病毒等作用[5]。免疫细胞具有更新代谢迅速的特点，在内源性核苷酸无法满足生理需求时，通过外源性核苷酸的补充，特别是药物及膳食内的核苷酸，也可参与到机体的免疫调节[6]中。其中，腺苷、腺嘌呤具有降压、降低心率、镇静抗惊厥等作用[6]。基于中药具有多成分、多靶点的特性，单一指标性成分不能全面反映中药的质量，因此中药质量标准“将从单指标向多指标、从指标性成分向药效成分控制”方向发展。本研究将对红曲中洛伐他汀及腺苷、腺嘌呤进行定量分析，为红曲质量控制提供数据支持。

1 仪器与药品、试剂

1.1 仪器

Agilent 1100 高效液相色谱仪（配有G1311A四元泵、G1313A 自动进样器、G1316A 柱温箱、G1314A 检测器及Chemstation（A.10.02）工作站）；AT-201 电子天平（瑞士Mettler-Toledo 公司）；Biofuge PrimoR 冷冻高速离心机（德国Heraeus 公司）；MIX-2500 混合仪（杭州佑宁仪器有限公司）。

1.2 药品与试剂

对照品：洛伐他汀（批号：100600-202006，纯度99.6%）、腺苷（批号：110879-201703，纯度99.7%）、腺嘌呤（批号：110886-201102，纯度99.4%）均购于中国食品药品检定研究院；酒用红曲（批号：210126001、210126002、210126008)、食用红曲（批号：210126003、210126004、210126007）均购自武汉佳成生物制品公司；药用红曲（批号：180914、190513、200612）购自桐君堂中药饮片公司；甲醇、乙腈、磷酸为色谱纯；其他试剂为分析纯；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent Zorbax SB-C18（4.6mm×150mm，5 μm）；流动相：A 为乙腈，B 为0.1%磷酸，梯度洗脱，见表1；柱温：40 ℃；检测波长：254 nm；流速：1.0 mL·min-1；进样量：20 μL。

表1 流动相梯度洗脱程序

2.2 对照品溶液的配制

分别称取腺苷、腺嘌呤及洛伐他汀对照品适量，精密称定，加入50%甲醇溶液溶解，配制成含腺苷6.40 μg·mL-1、腺嘌呤12.80 μg·mL-1、洛伐他汀64.00 μg·mL-1的混合对照品溶液。依次进行倍比稀释，结果见表2。

表2 3 种成分的浓度信息（μg·mL-1）

2.3 供试品溶液的制备

取本品约0.1 g，精密称定，加入50%甲醇，定容至10mL，超声处理15min，摇匀，4℃条件下12000 r·min-1离心10 min，精密吸取上清液1 mL，置10 mL量瓶中，50%甲醇定容，摇匀，即得供试品溶液。

2.4 系统适用性

取混合对照品溶液及供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样检测，结果显示，腺苷、腺嘌呤及洛伐他汀3 个成分理论塔板数均大于5000，分离度大于1.5。对照品溶液和供试品溶液的色谱图见图1。

图1 空白溶剂（A）、对照品（B）、药用红曲（C）、食用红曲（D）及酒用红曲（E）的色谱图

2.5 线性关系考察

精密吸取“2.2”项下系列混合对照品溶液各20 μL，按“2.1”项下色谱条件进样检测，以峰面积（Y）为纵坐标，浓度（X，μg·mL-1）为横坐标，计算标准曲线。结果表明，腺苷、腺嘌呤及洛伐他汀的质量浓度在相应范围内与峰面积呈良好线性关系。见表3。

表3 3 种成分的线性方程、相关系数及线性范围

2.6 稳定性试验

取药用红曲样品（批号：180914），按“2.3”项下方法制备供试品溶液，室温放置于自动进样器中，当放置0、4、8、12、24 h 时，按“2.1”项下色谱条件进样检测，记录峰面积。结果显示，腺苷、腺嘌呤、洛伐他汀峰面积的RSD 分别为0.9%、1.1%、0.6%（n=5），表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.7 重复性试验

取药用红曲样品（批号：180914），共6 份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液。按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果表明，腺苷、腺嘌呤、洛伐他汀含量的RSD 分别为0.8%、0.9%、0.5%（n=6），表明方法重复性良好。

2.8 加样回收率试验

精密称取已知含量的同一批药用红曲样品（批号：180914）0.050 g，分别精密加入各对照品溶液适量，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样检测，计算峰面积，根据标准曲线线性方程计算加样回收率。结果腺苷、腺嘌呤、洛伐他汀的平均回收率（n=6）分别为99.29%、101.64%、98.87%；其对应的RSD 分别为3.45%、4.41%、3.25%。

2.9 样品含量测定

分别取3 批不同来源的红曲，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，平行制备3 份，按“2.1”项下色谱条件分别进样测定，计算各批号的红曲中腺苷、腺嘌呤、洛伐他汀的平均含量。见表4。

表4 不同来源的红曲中3 种成分含量测定结果（n=3，mg·g-1）

3 讨论

本研究选用十八烷基硅烷键合硅胶为固定相。综合文献资料[7，8]，试验了如下几种流动相体系：甲醇-水、甲醇-0.05%磷酸、甲醇-0.1%磷酸、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸，结果发现，使用乙腈-0.1%磷酸作为流动相进行梯度洗脱，腺苷、腺嘌呤、洛伐他汀的峰形良好，分离度高，红曲中其他化合物对上述3种成分无干扰。此外，对腺苷、腺嘌呤、洛伐他汀在波长200～400 nm 进样扫描，结果发现，上述3 种成分的最佳吸收波长分别为260、260、238 nm，综合考虑各成分在红曲中的含量及对不同波长的敏感度，最终选择254 nm 作为检测波长。

红曲的前处理方法主要有超声提取法、柱层析法、回流提取法等，为了使操作步骤简化，所以选择直接超声提取法。还对超声时间、提取溶剂的种类（甲醇、乙腈、乙醇等）及其比例进行了考察，结果显示，超声10 min 时测得含量与15 min 时基本一致，超声至40 min 时含量无变化，为保证提取完全，确定超声时间为15 min，以50%甲醇的提取效率较高。

从含量测定结果看出，不同来源红曲中腺苷、腺嘌呤、洛伐他汀的含量均有一定的差异。其中，药用红曲在腺苷、腺嘌呤、洛伐他汀含量上明显高于其他两种红曲；食用红曲与酒用红曲在腺苷、腺嘌呤含量上差异较小，但洛伐他汀含量高于酒用红曲。

目前，红曲药材还未有“国家标准”，红曲的“地方标准”亦不统一，且多以显微鉴别和水分控制为主，难以合理引导国内红曲产业的规范化发展。红曲属于发酵产品，其发酵菌株、发酵方式、发酵时间、培养基质、pH 等因素均会影响红曲的产物种类和含量[9]。对此，建立中药红曲的质量标准是十分迫切和必要的。