非小细胞肺癌组织中PD-1、TIM-1的表达及其对预后的影响

陈 灿，郑林鑫，麦玉梅，李伟峰 (中国人民解放军南部战区总医院呼吸内科，广东 广州510000)

非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是一种常见的病理类型，约占肺癌的85%，早期发病隐匿，无明显症状，多数患者就诊时已属于中晚期，错过了最佳手术切除时机，预后极差[1]。NSCLC的治疗手段包括手术切除、化疗、放疗、免疫治疗等，通常采用以手术切除为主、放/化疗为辅的方式，但受肿瘤类型、个体差异、就诊时间等影响，患者5年生存率仅约16%，效果不够理想[2]。近年来，有研究发现宿主抗癌免疫的有效性与细胞毒性T淋巴细胞密切相关，T淋巴细胞介导的免疫应答是肿瘤免疫治疗的基础，而程序性死亡受体-1(programmed death receptor-1，PD-1)在活化T淋巴细胞中广泛表达，PD-1可通过与其配体结合，对肿瘤的免疫逃逸进行介导[3]。周舸等[4]发现肝细胞癌组织中PD-1的表达水平较癌旁组织高。黄健等[5]发现与癌旁组织相比，结肠癌组织中PD-1的表达水平也明显增高。这表明PD-1与多种肿瘤的发生有关，可能参与肿瘤进展。周鹏等[6]则认为T淋巴细胞免疫球蛋白和黏蛋白结构域分子1(T cell immunoglobulin and mucin domain-containing molecule-1，TIM-1)能促进免疫抑制，参与肿瘤细胞的免疫逃逸过程。基于此，本研究纳入125例NSCLC患者进行研究，旨在分析PD-1、TIM-1在NSCLC组织中的表达情况及二者与NSCLC患者预后的关系，以期为临床NSCLC的诊疗提供参考。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选取我院2016年1月至2019年6月收治的125例NSCLC患者开展前瞻性研究，其中男68例，女57例；年龄34～71岁，平均(55.39±12.71)岁；临床分期：Ⅰ期23例，Ⅱ期35例，Ⅲ期67例；病理类型：腺癌63例，鳞状细胞癌62例；分化程度：高分化58例，中低分化67例；淋巴结转移41例；肿瘤直径：≥3 cm 73例，<3 cm 52例。纳入标准：成年；经病理诊断证实为NSCLC；术前无免疫治疗、放疗、化疗史；病历资料及各项检查资料完整；无精神障碍、意识障碍，能配合研究。排除标准：患有严重心血管疾病、脑血管疾病、其他部位原发性肿瘤等危及生命的疾病；凝血功能障碍；因NSCLC复发就诊；患传染性疾病；出现远处转移。本研究获我院伦理委员会批准(2016012502)，所有患者均对本研究知情，并自愿签署同意书。

1.2 检测方法

主要仪器：石蜡切片机(德国Leica公司，RM2245型)、烤片机(武汉俊杰电子有限公司，JK-5型)、超低温冰箱(青岛海尔集团，DW86L338J型)、光学显微镜(日本OLYMPUS，CX21型)；主要试剂：抗PD-1抗体、抗TIM-1抗体(美国赛默飞世尔科技公司)。

采用免疫组化法检测NSCLC患者癌组织、癌旁组织(距离病灶3～5 cm)中PD-1、TIM-1的表达情况。免疫组化染色：组织样本经10%甲醛固定，并石蜡包埋，石蜡切片厚度为4 μm，置于载玻片备用。将切片分别经二甲苯Ⅰ、Ⅱ浸泡10 min，然后经无水乙醇Ⅰ、Ⅱ各浸泡10 min，经95%、85%乙醇各浸泡5 min，双蒸馏水冲洗5 min，经PBS清洗3次，每次5 min。加入3% H2O2甲醇，在室温下反应10 min，经PBS清洗3次。利用高压锅行抗原修复，采取柠檬酸钠缓冲液高温高压抗原修复法，取柠檬酸钠缓冲液加入沸水内，封盖。取玻片放置在金属染色架加热，使其经PBS浸泡5 min，加热完毕后去除热源，开盖，待样本自然冷却，经PBS清洗3次。滴入正常山羊血清(10%)，37 ℃反应20 min。弃血清，加入抗PD-1抗体或抗TIM-1抗体，4 ℃孵育过夜，经PBS清洗3次。甩去PBS，室温孵育过夜后37 ℃反应1 h。加入二抗，37 ℃反应40 min，经PBS清洗3次。甩去PBS，经DAB显色，控制染色深度，经双蒸馏水冲洗，终止染色。行苏木素复染，再次经双蒸馏水冲洗。脱水、透明，封片。

1.3 染色结果评估

评估方法[7]：光学显微镜下随机选择10个高倍视野(×400)进行观察，分析染色情况，以细胞浆、胞膜内出现黄色或棕黄色颗粒判定为阳性细胞。染色强度：无染色(0分)、淡黄色(1分)、棕黄色(2分)、棕褐色(3分)。阳性细胞占比：0～10%(0分)、11%～25%(1分)、26%～50%(2分)、51%～75%(3分)、75%以上(4分)。染色强度评分与阳性细胞占比评分的乘积≤2分为低表达，>3分为高表达。

1.4 随访

术后随访24个月，随访方式包括上门随访、电话随访、门诊随访，患者出院后根据医嘱定期复查。记录患者随访期间的无瘤生存率与总生存率。

1.5 统计学方法

采用SPSS 20.0软件进行数据分析，计数资料用率(%)表示，行χ2检验。采用Spearman相关系数分析PD-1与TIM-1表达的相关性，并分析二者与临床病理特征的关系。经多因素Cox回归分析影响预后的危险因素，采用Kaplan-Meier法计算生存率，log-rank检验比较不同PD-1、TIM-1表达患者的无瘤生存率与总生存率。以双侧P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 癌组织、癌旁组织PD-1、TIM-1的表达情况及二者表达的相关性分析

癌组织中PD-1、TIM-1高表达率高于癌旁组织(P<0.05)，见表1。免疫组化染色结果显示，PD-1、TIM-1在癌旁组织中无明显染色，在癌组织中可见明显的棕黄色或棕褐色染色，见图1。Spearman相关系数分析结果显示，PD-1与TIM-1表达呈正相关(r=0.745，P<0.001)。

a：癌旁组织中PD-1的表达；b：癌组织中PD-1的表达；c：癌旁组织中TIM-1的表达；d：癌组织中TIM-1的表达

表1 癌组织、癌旁组织中PD-1、TIM-1表达情况比较[n=125，例(%)]

2.2 NSCLC患者PD-1、TIM-1表达与临床病理特征的关系

根据PD-1、TIM-1表达情况分成PD-1、TIM-1高表达组与PD-1、TIM-1低表达组。PD-1、TIM-1高表达组临床分期Ⅲ期、中低分化、淋巴结转移、肿瘤直径≥3 cm的比例高于PD-1、TIM-1低表达组(P<0.05)，见表2。

表2 NSCLC患者PD-1、TIM-1表达与临床病理特征的关系[例(%)]

2.3 NSCLC患者生存与死亡情况及多因素Cox回归分析

随访期间，125例NSCLC患者中，死亡34例(27.20%)，生存91例(72.80%)。多因素Cox回归分析显示,临床分期Ⅲ期、中低分化、淋巴结转移、肿瘤直径≥3 cm及PD-1、TIM-1高表达是影响预后的危险因素(P<0.05)，见表3。

表3 NSCLC患者预后的多因素Cox回归分析

2.4 NSCLC患者PD-1、TIM-1表达与预后的关系

随访期间，PD-1高表达组的无瘤生存率为59.74%，总生存率为63.64%；PD-1低表达组的无瘤生存率为83.33%，总生存率为87.50%，PD-1高表达组的无瘤生存率、总生存率均低于PD-1低表达组(P<0.001)，见图2a、b。TIM-1高表达组的无瘤生存率为61.80%，总生存率为66.29%；TIM-1低表达组的无瘤生存率为83.33%，总生存率为88.89%，TIM-1高表达组的无瘤生存率、总生存率均低于TIM-1低表达组(P<0.001)，见图2c、d。

a：不同PD-1表达患者的无瘤生存曲线；b：不同PD-1表达患者的总生存曲线；c：不同TIM-1表达患者的无瘤生存曲线；d：不同TIM-1表达患者的总生存曲线

3 讨论

NSCLC是全球比较常见的癌症，具有较高的发病率、复发率、转移率、病死率。随着临床诊断技术的发展，NSCLC的检出率逐年增高，但受癌症浸润、转移、复发等因素影响，NSCLC的预后仍然欠佳，5年生存率未见明显改善[8]。既往临床采用常规肿瘤标记物(如鳞癌细胞抗原、癌胚抗原、神经元特异性烯醇化酶等)评估肺癌病情，虽然有一定价值，但总体作用有限，敏感度、特异度不理想，对预后的评估效果较差[9]。近年来，有研究发现PD-1与肿瘤的发生密切相关，其对外周组织内T淋巴细胞活性有抑制作用，使癌细胞形成免疫抵抗机制[10]。另有研究指出，PD-1与程序性死亡配体-1(programmed cell death-ligand 1，PD-L1)表达增高能促进肿瘤细胞增殖，导致病情进展[11]。此外，王巨等[12]发现TIM-1对辅助性T淋巴细胞1/辅助性T淋巴细胞2的平衡有调节作用，其在桥本甲状腺炎癌变患者中呈过表达，表明TIM-1也具有促癌作用。基于此，本研究通过探索PD-1、TIM-1在NSCLC中的表达情况及其对预后的影响，以期为NSCLC的诊治提供参考。

本研究结果显示，与癌旁组织相比，NSCLC组织中PD-1、TIM-1高表达率更高，且PD-1与TIM-1表达呈正相关，表明二者可能共同参与NSCLC的发生进展。T淋巴细胞所介导的免疫应答在抗肿瘤免疫中有重要作用，而T淋巴细胞活化需要依赖相关的协同刺激分子受体，PD-1是一种非常重要的介导负性协同刺激受体，在T淋巴细胞中存在表达，PD-1/PD-L1信号通路能对T淋巴细胞活化以及增殖进行抑制，导致T淋巴细胞凋亡，使癌细胞逃过免疫监视[13]。杨德松等[14]发现PD-1/PD-L1信号通路参与了NSCLC的进展，该信号通路具有负性调节作用，能抑制B淋巴细胞、T淋巴细胞受体信号路径的激活，从而抑制淋巴细胞增殖，帮助癌细胞免疫逃逸。TIM-1是TIM家族的重要一员，是共刺激分子，在T淋巴细胞表面存在表达，其异常表达可破坏T淋巴细胞亚群的免疫平衡，导致组织细胞出现恶变或者异常增生，引起癌变[15]。Halim等[16]指出TIM-1在正常组织内低表达，而在肾细胞癌、卵巢癌等恶性肿瘤中表达上调，这可能与其对免疫表型的调节作用有关，进一步证实了TIM-1具有促癌作用。由此可见，PD-1与TIM-1高表达均具有促癌作用，可能通过共同破坏T淋巴细胞功能，促进癌细胞增殖。本研究结果显示，NSCLC患者PD-1、TIM-1表达与肿瘤分期、分化程度、淋巴结转移、肿瘤直径有关。分析原因可能为PD-1、TIM-1在NSCLC中发挥促癌作用，二者表达水平越高，则越能促进癌症进展，导致NSCLC分期增高，分化程度降低，肿瘤增长速度加快，淋巴结转移风险增加。

已有研究证实，NSCLC患者的预后与肿瘤临床分期、淋巴结转移等因素有关[17]。本研究结果显示，临床分期Ⅲ期、中低分化、淋巴结转移、肿瘤直径≥3 cm是影响NSCLC患者预后的危险因素，与既往研究结论基本一致[18]。本研究还发现，PD-1、TIM-1高表达也是影响NSCLC预后的危险因素，且二者高表达可导致患者术后24个月的无瘤生存率、总生存率降低。PD-1能帮助癌细胞逃过免疫监视，而TIM-1可通过破坏T淋巴细胞亚群平衡，促进细胞恶变，二者均能加速癌症进展。Fujimoto等[19]发现，NSCLC患者经同步放/化疗后PD-1水平降低，且低表达的PD-1有利于改善患者预后，也提示PD-1表达与NSCLC预后有关，本研究结果与之吻合。但该研究未分析PD-1与NSCLC临床病理特征的关系，本研究分析了PD-1、NSCLC与患者临床病理特征及预后的关系，为NSCLC诊疗提供了更可靠的依据。

综上所述，PD-1、TIM-1在NSCLC组织中高表达，其高表达是影响NSCLC预后的危险因素，对患者无瘤生存率、总生存率有较大影响。但本研究也有局限性，如分析危险因素时纳入变量较少，未来还需进一步完善病历资料，纳入更多变量予以探讨。