lncRNA01535通过JAK/STAT3通路调节毛囊干细胞增殖和分化的作用研究*

朱 君,姜金豆,周建敏,董温云,黄亚奔,王佳雯

(1.温州医科大学温州市第三临床学院/温州市妇幼保健院/温州市人民医院整形外科，浙江温州325000；2.广东省妇幼保健院医疗美容科,广州 510010)

毛囊干细胞(HFSC)属于成年干细胞，在静态下显示出较强的增殖能力[1]。研究发现，HFSC具有多向分化潜能，可以分化为皮肤、毛囊、皮脂腺，并参与皮肤伤口的愈合过程[2]。研究表明，HFSC可以通过靶向Janus激酶(JAK)来诱导毛囊生长，HFSC通过上调信号转导与转录激活子3(STAT3)激活而分化为转运扩增细胞[3]。另1项研究表明，HFSC的体内转录调控可能受STAT3调控子调控：miR-128通过靶向STAT3来调节毛囊间充质干细胞向平滑肌细胞的分化[4]。长链非编码RNA(lncRNA)是指一类长度大于 200 nt但不编码蛋白的RNA分子，已被确定在细胞的增殖和分化中起作用。近年来，lncRNAs已成为许多人类疾病研究的重点，包括代谢和遗传性疾病、癌症和人类干细胞分化[5]。有证据表明，lncRNAs与细胞信号通路转导相关，也是细胞疗法的靶标[6-7]。分子信号传导机制已证实lncRNA通过调节HFSC的不同信号途径与多种细胞代谢过程相关[8]。截至目前，尚未见lncRNA01535在HFSC中的表达及其调控HFSC分化的机制研究，本研究拟分析lncRNA01535对HFSC增殖和分化的调控作用及JAK/STAT3通路在其中发挥的作用，为临床皮肤病的治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器

胎牛血清、青霉素、链霉素、10%十二烷基钠硫酸-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)、JAK一抗(1∶1 000)、STAT3一抗(1∶1 000)、GAPDH一抗(1∶2 000)购自美国Sigma公司(批号：ER-54863、KJ-5874.63、BV-5489.64、VB-471.65、F1555.52、G584.63、V6363.52)，lncRNA01535 mimics、lncRNA01535 inhibitor购自武汉金开瑞生物公司(批号：XS-474.36、VF-748.36)，DMEM培养基购自美国Hyclone公司(批号：DE-5596.56)；Lipofectamine2000购自美国Thermo Fisher Scientific公司(批号：WR-474.26)，细胞计数试剂盒8(CCK-8)、PrimeScript RT Master Mix试剂盒购自日本希森美康公司(批号：XC469.52、ZA-478.36)；油红O、细胞裂解液购自上海碧云天生物科技公司(批号：XQ-5858.45、XC-58.65)；膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(FITC)/碘化丙啶(PI)细胞凋亡检测试剂盒购自美国Vazyme公司(批号：XE-471.36)；细胞周期检测试剂盒购自武汉AmyJet Scientific公司；TRIzol试剂盒购自美国Invitrogen公司(批号：SC-458.36)，SYBR Select Master Mix、ABI 7300系统购自美国Applied Biosystems公司(批号：ED-585.36、EY-4741.65)；聚偏氟乙烯(PVDF)膜、增强的化学发光(ECL)显影剂购自美国Millipore公司(批号：MN-69853.2、DC-4523.54)；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗(1∶10 000)购自美国Merck KgaA公司(批号:W098.34)。Synergy Mx-89多模式酶标仪购自日本希森美康，WE-98流式细胞仪购自美国BD Biosciences公司，NanoDrop紫外分光光度计购自美国Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 细胞培养及分组

HFSCs细胞系购自中国科学院上海典型培养物保藏中心，在37 ℃、5% CO2、2% O2、93% N2培养箱中，用10%胎牛血清、1%青霉素和链霉素(100 IU/mL)的DMEM培养基(美国Hyclone)培养。细胞分为HFSCs组、lncRNA01535 mimics组、lncRNA01535 inhibitor组。HFSCs组细胞不做任何处理；lncRNA01535 mimics、lncRNA01535 inhibitor组细胞分别转染10 mL lncRNA01535 mimics、10 mL lncRNA01535 inhibitor。转染方法：取10 mL HFSCs液(细胞浓度为5×106/mL)接种于6孔板，分别取100 pmol的 lncRNA01535 mimics、lncRNA01535 inhibitor于200 μL DMEM培养基中，再加4 μL Lipofectamine2000混匀，室温孵育30 min，无菌PBS洗涤细胞，将上述混合液加入细胞孔内，6 h 后弃混合液，加入含10%胎牛血清的DMEM培养基培养。

1.3 细胞增殖存活的测定

CCK-8试剂盒分析细胞增殖。取对数期生长的HFSCs，将细胞以每孔5 000个细胞的密度接种于96孔板中，72 h后，将10 μL CCK-8溶液添加至每个孔中。在37 ℃下孵育1.5 h后，在酶标仪于450 nm处测量吸光度(A)值，存活率=(实验组A值-HFSCs组A值)/(实验组A值-蒸馏水空白调零组A值)×100%。

1.4 细胞分化水平测定

将HFSCs以5 000/孔的细胞密度接种于96孔板中。将细胞保持在1%琼脂包被上，分化18 d。10%甲醛溶液固定细胞1 h，随后用60%油红O染色10 min。分化率=油红O阳性细胞的比例/总细胞数×100%。

1.5 细胞周期、凋亡水平测定

将HFSCs与双重染色FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒混合，在室温下孵育10 min,上流式细胞仪分析细胞凋亡情况。根据细胞周期检测试剂盒的操作说明，将收集的细胞在70%乙醇中固定过夜。将细胞与100 μL PI于4 ℃避光孵育30 min，上流式细胞仪检测细胞周期分布。

1.6 细胞lncRNA01535、JAK、STAT3 mRNA水平测定

TRIzol法提取细胞总RNA，并使用NanoDrop紫外分光光度计测量RNA的纯度和浓度。通过PrimeScript RT Master Mix将1.5 μg RNA反转录为cDNA，然后于-20 ℃保存。使用SYBR Select Master Mix在ABI 7300系统中进行实时荧光定量PCR(RT-qPCR)反应，GAPDH的表达水平作为标准化的内参。相关mRNA的表达水平通过2-ΔΔCt法计算。引物购自广州富伦根有限公司，引物序列如下：GAPDH正向5′-CCA GCC GAG CCA CAT CGC TC-3′，反向5′-ATG AGC CCC AGC CTT CTC CAT-3′；lncRNA01535正向5′-GGG CGG CAG GTC ACT GAC AC-3′，反向5′-GCC AGC AGC CGC TGG CTT AG-3′；JAK正向5′-GCA ATA CTC GCC TTA CGG CT-3′；反向5′-TAC ACA CCT TGT AGT ACG CC-3′；STAT3正向5′-ACA ACT TTG GTA TCG TGG AAG G-3′，反向5′-ATG AGC CCC AGC CTT CTC CAT-3′。

1.7 细胞JAK、STAT3蛋白水平测定

各组HFSCs用细胞裂解液裂解以提取总蛋白。BCA法测定蛋白浓度。通过水浴变性后，加入蛋白上样缓冲液，并使用10% SDS-PAGE电泳分离蛋白，将蛋白质转移至PVDF膜上，并在室温下用5%牛血清清蛋白封闭1 h。随后，添加JAK、STAT3、GAPDH一抗在4 ℃下孵育过夜，然后添加辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗，在室温下孵育2 h，然后借助ECL显影剂进行显影。使用ImageJ软件(美国马里兰州国立卫生研究院)量化条带强度。

1.8 统计学处理

2 结 果

2.1 各组HFSCs细胞存活率比较

与HFSCs细胞组[(60.85±9.56)%]比较，lncRNA01535 mimics组细胞存活率[(73.54±9.26)%]升高，lncRNA01535 inhibitor组细胞存活率[(52.21±5.33)%]降低(P<0.05)；与lncRNA01535 mimics组比较，lncRNA01535 inhibitor组细胞存活率降低(P<0.05),差异均有统计学意义。

2.2 各组HFSCs细胞分化率、凋亡率及G1期细胞比例比较

与HFSCs细胞组比较，lncRNA01535 mimics组细胞分化率升高,细胞凋亡率和G1期细胞比例降低(P<0.05)，lncRNA01535 inhibitor组细胞分化率降低,细胞凋亡率和G1期细胞比例升高(P<0.05)；与lncRNA01535 mimics组比较，lncRNA01535 inhibitor组细胞分化率降低、细胞凋亡率和G1期细胞比例升高(P<0.05)，差异均有统计学意义。见表1，图1、2。

表1 各组HFSCs细胞分化率、凋亡率及G1期比较

2.3 各组HFSCs细胞lncRNA01535、JAK、STAT3 mRNA表达水平比较

与HFSCs细胞组比较，lncRNA01535 mimics组lncRNA01535、JAK、STAT3 mRNA表达水平升高(P<0.05)，lncRNA01535 inhibitor组lncRNA01535、JAK、STAT3 mRNA表达水平降低(P<0.05)；与lncRNA01535 mimics组比较，lncRNA01535 inhibitor组细胞lncRNA01535、JAK、STAT3 mRNA表达水平降低(P<0.05),差异均有统计学意义。见表2。

A:HFSCs细胞组；B:lncRNA01535 mimics组；C:lncRNA01535 inhibitor组。

A:HFSCs细胞组；B:lncRNA01535 mimics组；C:lncRNA01535 inhibitor组。

表2 各组HFSCs细胞lncRNA01535、JAK、STAT3 mRNA表达水平比较

2.4 各组HFSCs细胞JAK、STAT3蛋白表达水平比较

与HFSCs细胞组比较，lncRNA01535 mimics组细胞JAK、STAT3蛋白表达水平升高(P<0.05)，lncRNA01535 inhibitor组细胞JAK、STAT3蛋白表达水平降低(P<0.05)；与lncRNA01535 mimics组比较，lncRNA01535 inhibitor组细胞JAK、STAT3蛋白表达水平降低(P<0.05),差异均有统计学意义。见表3，图3。

表3 各组HFSCs细胞JAK、STAT3蛋白表达水平 比较

A:HFSCs细胞组；B:lncRNA01535 mimics组；C:lncRNA01535 inhibitor组。

3 讨 论

成体干细胞可以替代垂死的细胞并尽快修复受损的组织，因此在维持组织稳态方面起着至关重要的作用。HFSC对于毛囊的产生、维持和更新至关重要。除了体内正常的生理功能外，HFSC还被认为是深层皮肤损伤，组织工程和再生医学中伤口组织修复必不可少的干细胞。HFSC是血管工程和干细胞疗法的重要来源。更重要的是，HFSC具有增殖、集落形成、再生的特征，此外HFSC易于获取且侵入性小，因此备受关注。阐明HFSC增殖，分化，凋亡的分子机制至关重要。

LncRNA已证明在HFSCs多系分化进程中具有潜在作用。LncRNA PCAT1通过调节miR-329/Wnt10b轴参与间充质干细胞分化[9]；LncRNA5322通过PI3K/AKT信号途径调节毛囊干细胞增殖和分化[10]；lncRNA-H19被证明通过充当miR-199a-5p的内源性竞争RNA(ceRNA)来促进间充质干细胞的存活和血管生成能力[11]。有关基因治疗和新型伤口治疗的研究报道表明，有必要将表皮细胞和HFSCs视为不同的种群，lncRNA01535可以通过充当miR-19b-3p的诱饵来促进HFSCs的增殖[12]；此外，lncRNA01535可促进毛囊源性神经干细胞向雪旺细胞分化[13]。本研究分析了lncRNA01535对HFSCs增殖和分化的调控作用。结果显示：与HFSCs细胞组比较，lncRNA01535 mimics组、细胞存活率、细胞分化率升高，细胞凋亡率、G1期细胞比例降低；lncRNA01535 inhibitor组细胞存活率、细胞分化率降低，细胞凋亡率、G1期细胞比例升高(P<0.05)；与lncRNA01535 mimics组比较，lncRNA01535 inhibitor组细胞存活率、细胞分化率降低，细胞凋亡率、G1期细胞比例升高(P<0.05)。这表明lncRNA01535过表达刺激了HFSCs的增殖和分化，抑制了HFSCs凋亡，而lncRNA01535表达抑制了HFSCs的增殖和分化，促进了HFSCs凋亡；表明lncRNA01535可调控HFSCs的增殖和分化。

为了研究lncRNA01535调节HFSCs增殖和分化的机制，本研究评估了JAK/STAT3通路。结果表明，在lncRNA01535 mimics转染的HFSCs中JAK、STAT3基因与蛋白的表达显著增加。有研究报道JAK能够调节人骨髓干细胞中骨形态发生蛋白2诱导的β-catenin活化[14]。还有研究表明JAK/STAT3通路在人类神经干细胞向神经元分化中起关键作用[15]。本研究结果显示，与HFSCs细胞组比较，lncRNA01535 mimics组lncRNA01535 mRNA，JAK、STAT3 mRNA和蛋白表达水平升高，lncRNA01535 inhibitor组细胞lncRNA01535 mRNA，JAK、STAT3 mRNA和蛋白表达水平降低(P<0.05)；与lncRNA01535 mimics组比较，lncRNA01535 inhibitor组细胞lncRNA01535，JAK、STAT3 mRNA和蛋白表达水平降低(P<0.05)。这说明lncRNA01535过表达导致HFSCs中JAK/STAT3通路的表达上调。JAK是胚胎成纤维细胞中lncRNA01535的直接靶基因[16]。此外，已有研究证明lncRNA01535可以与JAK特异性结合以调节人间充质干细胞的成骨分化[17]。此外，在肝细胞癌(HCC)中发现lncRNA01535表达与JAK表达呈正相关，并且JAK升高可预示HCC患者的预后不良[18]。此外已有研究证明lncRNA01535靶向STAT3参与人毛囊来源的间充质干细胞(HF-MSC)向平滑肌细胞(SMC)的分化过程，可作为SMC的组织工程和再生医学的潜在靶标[19]。综上所述，lncRNA01535促进HFSCs的增殖和分化；其机制可能与lncRNA01535激活HFSCs中JAK/STAT3通路有关。