虾青素保护AFB1 诱导AML12 细胞损伤的最适浓度筛选

任欣慧 ，姚强 ，黄庆年 ，朱彦彬 ，王琳 ，张月莹 ，陈志宝

（1.黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院，大庆 163319；2.中国动物疫病预防控制中心；3.广东海洋大学滨海农业学院）

近年来，随着公众对食品卫生安全问题的关注，有关霉菌毒素污染的问题亟待解决。黄曲霉在自然界中是一种常见的腐生真菌[1]，多见于发霉的花生，玉米，小麦，油菜籽等农作物中[2]，随着畜牧业的迅猛发展，动物饲料中也经常能检测到黄曲霉的存在。一般来说，长期处于湿热环境且营养价值丰富的食物更易被黄曲霉污染，且不易去除，滋生毒素危害健康。黄曲霉毒素（Aflatoxin，AFs）是黄曲霉等一系列霉菌的次级代谢产物[3]，其中AFB1 是已知黄曲霉毒素中毒性最强的物质，并且有着超强的致癌性，其毒性约为 HCN 的 10 倍，As2O3的 68 倍，致癌效应约为 N，N-二甲基亚硝胺的 75 倍，1，2，3-三嗪-2，4，6-三胺的416 倍，奶黄油的900 倍[4]，是目前研究最为广泛且危害最强的一种真菌毒素[5]。AFB1 对人和动物内脏器官都有影响，尤其对于肝脏的破坏能力极强，长期低剂量的摄入AFB1 更会诱发肝癌的产生。有研究表明，AFB1 是引起肝脏坏死、空泡变性、脂肪变性、巨噬细胞增多和肝细胞双核化等组织病理学改变的最强肝毒剂，此外，还观察到胆管增生和门静脉周围纤维化[6]。随着研究的不断深入，霉菌毒素污染得到了初步的控制，但在玉米等农作物、兽用饲料中检测出AFB1 的新闻依旧屡见不鲜[7]，因此，寻找有效手段干预AFB1 中毒已成为亟待解决的问题。

据研究表明，AFB1 对肝脏细胞内部会产生损伤，包括肝细胞的脂质损伤和线粒体损伤，严重会导致肝癌，可以发现，氧化应激可能是AFB1 导致肝损伤的一个重要潜在致病因素[8]。另外曾有研究提出，通过在饲料中添加抗氧化剂来提高机体内的抗氧化能力，可以缓解霉菌毒素造成的机体损伤[9]。因此我们推测，强效抗氧化剂的应用可以有效缓解AFB1 对机体造成的损伤。查阅大量资料后发现，虾青素（AST）作为一种脂溶性的物质，通常以蛋白质、酯化、游离三种形式存在，是迄今为止发现的强劲的天然抗氧化剂。随着对虾青素研究的深入，越来越多的国家同意并批准了虾青素可在日常生活中使用，并且发现，虾青素的淬灭单线态氧的能力是其他抗氧化物无法比拟的[10]。虾青素在进入体内后，会在组织中积累，并无毒性作用[11]。在大量的体外研究发现，虾青素的强抗氧化能力离不开其稳定的膜结构，其分子的极性末端可以横跨细胞膜，降低膜的通透性，由于提高了细胞膜的机械强度，使过氧化物启动子无法轻易的进入胞内，从而缓解细胞的氧化损伤[12]。

研究通过CCK-8 实验筛选虾青素和AFB1 最适药物浓度及时间，建立AFB1 诱导的AML12 细胞损伤模型，以此探究虾青素预保护对于AFB1 诱导的AML12 损伤的保护作用，为后续研究打下基础。

1 材料和方法

1.1 细胞

AML12 小鼠肝实质细胞系，来自实验室保藏细胞，经鉴定后使用。

1.2 主要仪器试剂

主要仪器：Thermo 二氧化碳恒温细胞培养箱、水浴锅、高速离心机、KQ-600DB 型超声波破碎仪、ELx800 型酶标仪、倒置显微镜、生物安全柜、96 孔细胞培养板。

主要试剂：虾青素（批号：0000091156，纯度＞97%，美国 Sigma 公司），AFB1（批号：2J1J17，纯度＞99%，Pribolab 公司），DMEM-F12 培养基（Hyclone 公司），100×青链霉素混合液、胰蛋白酶-EDTA 消化液、磷酸盐缓冲液（Biosharp 公司），二甲基亚砜（Solarbio试剂公司），胎牛血清（Clark 公司），胰岛素-转铁蛋白-硒（Gibco 公司），地塞米松（纳川生物技术公司），CCK-8 试剂盒、台盼蓝溶液（Beyotime 公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 细胞培养

配制完全培养基，500 mL 的DMEM-F12 中内包含地塞米松 40 ng·mL-1、10%的 FBS、1%的 ITS 以及1%的100×青链霉素混合液。取出液氮中冻存的AML12 细胞，37 ℃迅速融化，加入双无培养基以取出冻存液，随后将其接种至DMEM-F12 完全培养基中，放于培养箱中进行培养，温度37 ℃、5%CO2。定时观察细胞形态，更换培养液，当细胞贴壁生长至90%左右时，进行传代，通过细胞计数使细胞密度保持在1×105个·mL-1，将细胞铺至 96 孔细胞板中继续培养。

1.3.2 细胞分组

将细胞分4 组：溶剂对照组（C 组）、药物模型组 （AFB1 组，浓度梯度分 别为 0、5、10、15、20、40 μmol·L-1）、虾青素组（AST 组，浓度梯度分别为 0、20、50、100、150、200 μmol·L-1）、虾青素+黄曲霉毒素B （AST+AFB1 组，AST 的浓度梯度分别为 20、50、100、150、200 μmol·L-1，AFB1 浓度为 20 μmol·L-1）。C 组为0.01% DMSO 溶剂对照组。每个浓度梯度重复5 次。

1.3.3 CCK-8 法检测不同浓度时间AFB1 对AML12细胞影响

参照“1.3.1”的步骤在96 孔板中进行细胞的贴壁培养，培养体系200 μL，培养箱中培养条件为温度37 ℃、5% CO2。用 DMSO（细胞级）溶解 AFB1 粉末，配置成1 mg·mL-1储备液，临用前用DMEM-F12 双无培养基稀释，配置成 0、5、10、15、20、40 μmol·L-1共6 个浓度梯度。

观察细胞形态，达到试验标准后，弃去96 孔板中残留的培养基，用 PBS 清洗，随后加入 0、5、10、15、20、40 μmol·L-1AFB1 的培养基，分别进行 6、12、18、24 h 的处理。处理结束后，弃96 孔板中残留的培养液，PBS 清洗两次后，参照CCK-8 说明书进行实验。100 μL 的培养体系中加入 10 μL 的 CCK-8 溶液；200 μL 的培养体系中加入 20 μL 的 CCK-8 溶液，依照培养细胞的条件在培养箱内再培养1～2 h。培养结束后用酶标仪在450 nm 处测定吸光度，以溶剂对照组作为空白组，通过计算各组间吸光度的比值，来比较在不同时间下不同浓度的AFB1 药物的刺激对于AML12 细胞存在怎样的影响，确定AFB1 对细胞半数致死剂量。

1.3.4 CCK-8 法检测不同浓度虾青素对AML12 细胞影响

参照“1.3.1”的步骤进行细胞贴壁培养。用DMSO（细胞级）溶解虾青素，配置成5 mg·mL-1的虾青素储备液，使用前用DMEM-F12 双无培养液稀释，配置成0、20、50、100、150、200 μmol·L-1共 6 个浓度梯度。

观察细胞形态，达到试验标准后，弃去96 孔板中残留的培养基，用 PBS 清洗，随后加入 0、20、50、100、150、200 μmol·L-1虾青素的培养基。处理结束后，弃96 孔板中残留的培养液，PBS 清洗两次后，参照CCK-8 说明书进行实验。在加入CCK-8 溶液后，依照培养细胞的条件在培养箱内再培养1～2 h。培养结束后用酶标仪在450 nm 处测定吸光度，通过计算各组间的吸光度来判断虾青素对于AML12 细胞的影响，主要判断虾青素对细胞是否存在损伤，来确定虾青素对AML12 细胞处理的安全浓度范围。

1.3.5 CCK-8 法筛选虾青素、AFB1 最适浓度时间范围

依旧参照“1.3.1”的步骤进行细胞贴壁培养。观察细胞形态，达到试验标准后，弃去96 孔板中残留的培养基，用 PBS 清洗，加入 20、50、100、150、200 μmol·L-1的不同浓度的虾青素，分别对细胞进行3、6、9、12 h 四个不同时间的培养。时间结束后，弃掉96 孔板中残留培养液，PBS 洗两次，再加入含有20 μmol·L-1AFB1 的培养液，按要求在培养箱内再培养24 h，处理结束后，弃96 孔板中残留培养液，参照CCK-8 说明书进行实验。在加入CCK-8 溶液后，依照培养细胞的条件在培养箱内再培养1～2 h。培养结束后用酶标仪在450 nm 处测定吸光度，以观察AFB1 对AML12 细胞的损伤是否会因为虾青素的预保护得到缓解，根据吸光度来确定最佳处理浓度范围及时间。

1.3.6 数据分析

将收集的数据进行初步整理后使用SPSS 统计软件进行分析，采用Duncan's 法对各处理组进行多重比较分析，对符合样本运用GraphPad Prism 5 软件测试正态性，单因素方差分析。整理数据，汇成柱状图，以便查看。

2 结果与分析

2.1 不同浓度时间AFB1 对AML12 细胞影响

对 AML12 细胞进行 0、5、10、15、20、40 μmol·L-1不同浓度及 6、12、18、24 h 不同时间的 AFB1 作用于细胞，通过测定各组吸光度值，来计算AML12 细胞活力。结果如图1 所示：随着各组用药浓度的增加，各处理时间下的细胞活性呈现出下降趋势。AFB1 浓度为 10、15、20、40 μmol·L-1作用 6、12、18 h 后，细胞数量呈剂量依赖性下降趋势（P＜0.05）。在药物作用24 h 后，5、10、15、20、40 μmol·L-1浓度下对细胞都有明显的抑制作用（P＜0.05），这种趋势在 20 μmol·L-1作用24 h 后逐渐趋于平缓。在经过CCK-8 检测得到OD 值后，经过换算得到AFB1 对细胞的半数致死量浓度为 20 μmol·L-1。因此确定 24 h、浓度为 20 μmol·L-1的AFB1 作为实验的最佳条件。

图1 不同浓度时间AFB1 对AML12 细胞影响Fig.1 The effect of AFB1 at different concentration and time on AML12

2.2 不同浓度虾青素对AML12 细胞影响

为了筛选出虾青素对AML12 细胞的安全浓度范围，用不同浓度梯度的虾青素对AML12 细胞进行刺激，浓度分别为：0、20、50、100、150、200 μmol·L-1的虾青素，作用于细胞24 h。通过CCK-8 法测定AML12 细胞活力变化。从结果可以看出，与未加入虾青素的对照组比较，虾青素的剂量在20、50、100、150 μmol·L-1时，细胞活性未见明显的变化，这说明在150 μmol·L-1范围前浓度梯度的虾青素对细胞没有明显的损伤。而在200 μmol·L-1的浓度作用时，细胞数量有所降低，这说明200 μmol·L-1的虾青素对AML12 细胞的生长有一定的抑制作用，为了排除药物对细胞产生损伤，最终将药物筛选的剂量范围控制在 150 μmol·L-1以内较为安全。

2.3 虾青素、AFB1 最适浓度时间范围

前期实验确定了建立细胞模型中AFB1 最佳刺激浓度及时间，以及相对安全的虾青素浓度范围，为了进一步确定虾青素对AFB1 诱导的AML12 细胞的剂量，进行后续实验。为了筛选虾青素保护AFB1 诱导AML12 细胞损伤的剂量梯度及保护时间，在用0、20、50、100、150 μmol·L-1的虾青素刺激细胞 3、6、9、12 h 后，加入 20 μmol·L-1的 AFB1 培养 24 h。通过CCK-8 法测定细胞活力变化。从结果可以看出，在虾青素预保护的细胞中，AFB1 对于AML12 细胞的抑制作用得到了明显的改善。虾青素预保护3、6 h 时，细胞活性呈剂量依赖性的增长（P＜0.05）；虾青素预保护 9、12 h 后，这种增长在虾青素浓度为 150 μmol·L-1时有降低，且在虾青素预保护9 h 后组间差异明显增加。综合以上考虑，最终确定虾青素预保护AFB1 诱导的AML12 细胞的时间为3 h，剂量梯度为20、50、100 μmol·L-1。

图2 不同浓度虾青素对AML12 细胞影响Fig.2 The effect of AST at different concentration on AML12

3 讨论与结论

AFB1 在动物饲料中存在十分广泛，对畜牧业生产造成严重的经济损失。日常生活中，也经常能看到在玉米、花生等农作物中检测出黄曲霉毒素的新闻，这一切对人类和动物健康都有着非常大的威胁。通过整理对AFB1 的理化性质发现，其在污染的食物和饲料中性质十分稳定，耐高温、耐酸且不溶于水，存放20 年之久依旧可以检出[13]。不难看出，想要彻底清除AFB1 是一项困难艰巨的任务。在通过对流行病学进行研究整理后发现，AFB1 是造成肝癌发生的一大罪魁祸首[14-15]，因为肝脏是AFB1 进入人体后最主要的靶器官，长期低剂量的暴露在AFB1 中会引起肝脏胆小管增生、脂肪变性等病症，甚至发生癌变[16]。机体在摄入AFB1 后，进行第一关卡效应，经由消化道的十二指肠进行吸收，进入肝脏后，再由肝细胞相关代谢酶将其转化为AFB1-8，9 环氧化物，即AFBO，是AFB1 造成机体紊乱甚至致癌作用中最主要的原因[17]。为了尽可能的模拟AFB1 在体外吸收代谢的环境，实验中选择AML12 小鼠肝实质细胞系作为实验体，利用药物对AML12 小鼠肝实质细胞进行刺激，研究结果与预期一致，AFB1 对细胞造成了损伤，在5、10、15、20、40 μmol·L-1的 AFB1 作用不同时间时对AML12 细胞都有不同程度的抑制作用，并在20 μmol·L-1作用 24 h 时达到半数致死量，从而证实了后续实验的可行性。

图3 虾青素、AFB1 最适浓度时间范围Fig.3 Optimal concentration time range of AST and AFB1

有研究证实，AFB1 会参与机体内部的代谢过程，并在此过程中通过引发肝细胞的氧化应激[18]，使机体受到氧化应激产生的大量ROS 的刺激，引起机体损伤。根据Chen 等[19]的研究发现，在AFB1 诱导的毒性中，氧化应激和细胞凋亡可能是发挥关键性作用的原因，AFB1 的促氧化能力在一定程度上加强了其毒性能力。由此做出推断，抗氧化物的应用可以缓解甚至抑制AFB1 诱发的肝毒性，尤其是自然界中的天然抗氧化产物。

在20 世纪80 年代，科学家们对虾青素生理功能的研究逐渐深入，从此虾青素作为自然界中最强的抗氧化物出现在大众面前。石丽丽等[20]对虾青素进行了毒理学安全性评价，从一系列的毒理学评价试验结果来看，虾青素对于机体无明显的毒副作用。在通过利用不同浓度虾青素对AML12 细胞进行刺激后，虾青素对于细胞的影响的双向的，适当的药物浓度和处理时间，会促进AML12 细胞增殖，浓度不超过150 μmol·L-1的虾青素对细胞无明显毒副作用；而在虾青素浓度为 200 μmol·L-1时，对 AML12 细胞增殖有一定的抑制作用，药物浓度过大对细胞仍会造成部分损伤。但 150 μmol·L-1到 200 μmol·L-1浓度之间的虾青素是否有影响尚未可知，还需要进一步的探究。对比来看，体外实验只能作为体内实验的前期基础，更精准的结果必须进行一定量的体内实验，才能更为准确。

虾青素作为天然的抗氧化剂，安全绿色无公害，比目前绝大多数抗氧化剂都有优势[21]。通过利用虾青素对细胞进行体外实验，发现虾青素的抗氧化作用增强了细胞整体的抗氧化能力，对氧化应激生成的大量ROS 有一定的抑制作用，以此来减轻自由基所造成的损伤[22-23]。根据实验结果得出结论，虾青素能够细胞以减轻AFB1 造成的损伤。在不同浓度及时间的虾青素预处理AML12 细胞后，再利用20 μmol·L-1的AFB1 刺激24 h，可以看出细胞存活率有了明显的上升，因此将最适药物浓度筛选实验中虾青素浓度设置为 20、50、100 μmol·L-1。CCK-8 实验结果显示，AFB1 组的细胞OD 值低于AST+AFB1 处理组，证明了虾青素可以保护细胞因AFB1 造成的损伤，为今后研究提供了理论支持。

综上所述，AFB1 的半数致死量为 20 μmol·L-1，作用时间 24 h；20、50、100 μmol·L-1的虾青素预处理细胞3 h 后，可以较好的保护AFB1 诱导的细胞损伤，这为今后进一步研究虾青素用于预防AFB1 所致的肝损伤打下了基础。