莆田地区育龄女性MTHFR C677T基因多态性及血清HCY水平相关性分析

张如婧， 廖常希， 徐美妹， 王志苹， 林华

亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenetetrahydrofolate reductase， MTHFR)是叶酸代谢的关键酶之一，C677T和A1298C是该酶基因常见的两个突变位点，其中C677T位点胞嘧啶转胸腺嘧啶突变使酶对热不稳定而降低活性，可引起叶酸利用障碍[1]。叶酸的缺乏或叶酸利用能力的下降将导致血浆中同型半胱氨酸(homocysteine， HCY)转化异常而蓄积，引起高HCY血症[2]。多项研究表明，MTHFRC677T多态性及高HCY血症与胎儿神经管缺陷、先天性心脏病、唇腭裂等不良妊娠结局关系密切[3-6]。

中国疆域辽阔，MTHFRC677T多态性在不同地区差异显著[7]。笔者以莆田地区育龄女性为研究对象，通过测定血清HCY浓度，分析MTHFRC677T基因遗传特征对HCY浓度的影响，为围孕期女性科学增补叶酸提供依据。

1 对象与方法

1.1 对象 选取2019年2月—2021年5月在莆田学院附属医院进行婚、孕前检查的汉族育龄女性608例，年龄(28.15±4.65)岁(19～42岁)。排除标准：(1)籍贯非莆田市；(2)有高血压病家族遗传病史；(3)近2周服用过叶酸、维生素B等营养补充剂或药物。本研究经莆田学院附属医院伦理委员会批准(莆医附伦[2021027])，患者或亲属均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 试剂与仪器MTHFRC677T基因检测试剂盒(西安金磁纳米生物技术有限公司)，HCY试剂盒(浙江康特生物科技有限公司)，PCR仪(ABI 7500型，美国Life公司)，全自动生化分析仪(E170型，罗氏诊断产品上海有限公司)。

1.2.2 基因组DNA模板的获取 静脉采集研究对象的EDTA-K2抗凝全血2 mL，混匀后取10 μL全血与20 μLMTHFRC677T基因检测试剂盒中配套的样本稀释液旋涡混匀。待血液变为暗红色时，即可作为模板液进行PCR实验，注意处理后的稀释样本需在5 min内加入PCR反应体系。

1.2.3MTHFRC677T基因扩增 取5 μL模板液分别加入45 μL含突变T基因特异引物的“M扩增液”或含野生C基因特异引物的“WT扩增液”PCR反应体系，基于MTHFRC677T基因突变位点的引物标记与特异性PCR扩增，获得标记有地高辛分子的特定扩增片段，扩增程序为：50 ℃ 2 min；95 ℃ 3.5 min；94 ℃ 5 s→60 ℃ 10 s→65 ℃ 30 s，31个循环；65 ℃ 10 min；4 ℃ 维持。

1.2.4MTHFRC677T基因分型判读 取40 μL“M扩增产物”或“WT扩增产物”加于纳米金磁微粒检测卡的对应样品垫处，基于地高辛标记抗体反应，通过侧向流层析技术实现MTHFRC677T基因多态性的检测，待5 min后对结果进行判读，20 min 内判读有效。MTHFRC677T基因分型判读方法见图1。

M：突变T基因扩增产物检测条；WT：野生C基因扩增产物检测条。图1 MTHFR C677T基因检测卡结果判读Fig.1 Interpretation of the results of MTHFR C677T gene detection card

1.2.5 血清HCY含量检测 静脉采集肝素抗凝全血2 mL，2 808 ×g离心3 min，吸取0.5 mL血清于反应杯中，置于E170全自动生化分析仪上测定血清HCY水平(循环酶法)，每批测定前的定标与质控均为配套试剂。

1.3 其他地区MTHFRC677T多态性数据的获取 在数据库MEDLINE、中国知网、万方、维普上检索国内其他地区汉族育龄女性MTHFRC677T多态性数据，中文关键词“亚甲基四氢叶酸还原酶”“基因多态性”，英文关键词“MTHFR”“polymorphisms”。文献纳入标准：(1)2020—2021年发表；(2)可体现当地汉族育龄女性MTHFRC677T各基因型频数；(3)研究中MTHFRC677T多态性数据符合Hardy-Weinberg平衡定律。排除标准：(1)数据不全；(2)纳入样本带有随机性影响，如病例对照研究。若同一省内含不止1项符合标准的研究，择取高质量且样本量较大的文献。

2 结 果

2.1 Hardy-Weinberg遗传平衡 共纳入608例病例，以Hardy-Weinberg平衡检验对莆田地区MTHFRC677T位点多态性进行分析，χ2=2.103(P>0.05，表1)，表明该样本MTHFRC677T位点分布特点具有莆田地区群体代表性。

表1 MTHFR C677T基因分布的Hardy-Weinberg检验Tab.1 Hardy-Weinberg test of MTHFRC677T gene distribution

2.2MTHFRC677T位点基因分布情况 608例中，MTHFRC677T以野生CC型为优势基因型，占比47.9%(291例)，杂合CT型和纯合TT型分别占比40.8%(248例)和11.3%(69例)，突变 T基因频率为31.7%。3种基因型分布与省内已有报道的厦门地区育龄女性数据比较，差别无统计学意义(P>0.05)；与广东广州地区相似，差别无统计学意义(P>0.05)；与河南郑州、河北廊坊、内蒙古赤峰、新疆塔城、陕西延安、上海、四川乐山、湖北武汉、浙江台州、贵州贵阳、江西新余、云南大理地区比较，差别有统计学意义(P<0.01)。本研究中莆田地区T基因频率与同样以纯合CC型为主的福建厦门、广东广州地区比较，差别无统计学意义(P>0.05)，而显著低于以杂合CT基因型为主的其他地区，差别有统计学意义(P<0.01，表2)。

表2 莆田地区与其他地区育龄女性MTHFR C677T位点基因分布比较Tab.2 Comparison of MTHFR C677T gene distribution between childbearing women in Putian city and other regions

2.3MTHFRC677T不同基因型与HCY水平的关系 对研究样本的HCY浓度测定显示，血清HCY水平随着MTHFRC677T位点突变程度的增加而增加。野生CC、杂合突变CT、纯合突变TT基因型育龄女性HCY水平分别为(8.48±2.32)、(9.14±3.38)及(12.68±4.71) μmol/L。单因素方差分析显示，组间HCY水平比较，差别有统计学意义(F=50.778，P=0.000)。进一步行SNK检验两两比较显示，杂合CT基因型与纯合突变TT基因型血清HCY水平显著高于野生CC型，差别有统计学意义(P<0.05)；杂合CT基因型血清HCY水平略高于纯合CC基因型，差别无统计学意义(P>0.05，图2)。

MTHFR：亚甲基四氢叶酸还原酶基因；HCY：同型半胱氨酸；CC：纯合野生型；CT：杂合突变型；TT：纯合突变型。MTHFR C677T CC、CT分别与TT比较，#：P<0.05。图2 MTHFR C677T不同基因型的HCY水平Fig.2 HCY levels of different MTHFR C677T genotypes

3 讨 论

MTHFR在参与叶酸的代谢、促进HCY的转化及DNA合成中发挥重要作用，其中C677T为MTHFR基因最常见的碱基突变位点。有研究表明，携带杂合CT突变的MTHFR活性为纯合CC型的65%，而纯合TT突变者该酶活性降至30%[22]。若纯合突变MTHFR677TT基因型孕妇叶酸摄入不足，血清内HCY水平或将升高，生育出生缺陷患儿风险也将大大增加。适当地补充叶酸是降低出生缺陷的经济高效方法，现已成为全球性的公共卫生干预措施。然而，过多的叶酸摄入或将掩盖维生素B12缺乏引起的恶性贫血，也可能增加妊娠期糖尿病、婴儿哮喘等发病风险[23-25]。因此，明确各地区MTHFR基因分布特征和叶酸代谢能力，及该遗传特点对HCY水平的影响，对各地育龄女性合理增补叶酸的指导尤为重要。

以文中参考的几个地区数据来看，福建厦门、广东广州地区汉族育龄女性以野生CC基因型为主，其余地区以CT杂合突变为优势基因型，总体上突变T等位基因频率自南向北逐渐递增。笔者首次对莆田地区育龄女性MTHFRC677T位点多态性分析，与省内已报道的厦门地区该基因多态性差别无统计学意义[8]，在补充福建省遗传数据库的同时，也表明了该基因分布或具有福建地区代表性。本研究中，莆田地区突变T基因频率低于华南以北地区的特点，恰好符合国内突变T基因自南向北增高的整体趋势。各地区MTHFR基因分布的大幅度差别，或是导致常规叶酸补充预防出生缺陷效果差别的重要原因，也可解释中国南方地区神经管畸形出生缺陷低于北方地区的特点[26]。

现已明确高水平的HCY可使甲基转移酶受抑制出现低甲基化，易造成染色体分离障碍，可能与先兆子痫、早产、胎盘早剥、胎儿生长受限等妊娠并发症相关[27-31]。中国妇幼保健协会建议高HCY血症妇女每日增补至少5 mg叶酸，直至HCY降至正常后再考虑受孕，在叶酸增补基础上每日补充维生素B12可进一步降低HCY水平[32]。基于叶酸0.7 h的生物半衰期，本课题研究对象排除了近2周有补充叶酸、维生素B的育龄女性，以及可能影响HCY浓度的高血压家族遗传病史者，目的为在尽量降低该研究选择偏倚的情况下检测血清HCY的基线水平[33]。本研究中，纯合突变TT基因型的HCY水平显著高于野生CC型和杂合CT型，差别具有统计学意义，证实了MTHFR基因突变对血浆中HCY浓度的影响。中国妇幼保健协会《围受孕期增补叶酸预防神经管缺陷指南》与加拿大妇科医师协会关于孕期补充叶酸的指南均提出针对不同MTHFRC677T基因型及HCY水平的叶酸补充方案[32,34]。在无条件进行MTHFR基因检测的基层地区或人群，HCY检测或可辅助指导围孕期女性的叶酸补充，在达到较好出生缺陷预防效果的同时，降低过量补充叶酸的风险。

综上所述，MTHFRC677T是出生缺陷易感的重要基因，各地该基因多态性存在很大差别，其遗传特征所致叶酸利用能力差别使得常规的叶酸补充无法满足所有围孕期女性的需求。本研究丰富了福建省MTHFRC677T多态性遗传信息库，针对育龄女性进行叶酸代谢基因MTHFR的检测或在孕期进行HCY水平的监测，并予以个体化的叶酸补充，或将更精准地达到降低出生缺陷、优生优育的目的。