负载人脐带间充质干细胞新型盆底补片的构建及其在大鼠的应用*

金克勤， 骆健峰，2▲△， 苏爱芳， 丁明星， 傅赛红 ， 方远书

（1金华市妇幼保健院遗传实验室，浙江 金华 321000；2浙江大学医学院附属金华医院分子实验室，浙江 金华 321000；3金华职业技术学院医学分子生物学实验室，浙江 金华 321007；4金华市食品药品检验检测研究院，金华实验动物中心，浙江 金华 321000）

盆腔器官脱垂（pelvic floor prolapse，POP）最重要的手术治疗方式——盆底重建手术已占到普通妇科大手术的40%~60%。由于盆底结构及力学的复杂性，有高达19%的术后复发率，存在再次手术的风险［1］。文献报道，在盆底重建中，利用脂肪源性干细胞（adipose-derived mesenchymal stem cells，ADSCs）构建组织工程补片，是一种潜在的治疗策略［2］，在临床上有巨大的应用潜能［3］。脐带间充质干细胞（umbilical cord mesenchymal stem cells，UC-MSCs）在增殖和细菌/病毒感染风险方面更具优势，且移植排斥反应机率低。然而，有关UC-MSCs 应用于盆底重建的研究较少，需更多的证据。应用丝心蛋白（silk fibroin，SF）、胶原（collagen，COL）、聚乳酸（polylactic acid，PLA）等网状支架的实验研究证实，辅加UCMSCs 的支架材料修复效果优于单纯的支架材料，其机制可能与促进血管新生、减少局部粒细胞和巨噬细胞的浸润及免疫调节等有关［4-5］。本研究采用复合UC-MSCs 与SF/COL/聚（左旋乳酸-己内酯）［poly（L-lactide-co-ε-caprolactone），PLCL］静电纺丝纳米纤维支架构建新型盆底补片，并进行体内实验研究，探索其修复的可行性，为其在女性盆底重建手术中的应用提供实验依据。

材料和方法

1 实验动物

SPF 级雄性SD 大鼠，4 周龄，购自上海斯莱克有限公司，许可证号为SCXK（沪）2017-0005，合格证号为20170005019883。实验动物房使用许可证号为SYXK（浙）2015-0008。实验过程中对动物处置符合国科发财字〔2006〕398号文件规定。

2 主要试剂

人UC-MSCs由浙江思丹姆干细胞生物科技有限公司提供；SF 委托天津医院提取；猪I 型COL 购自成都市科乐生物技术有限公司；PLCL 由济南岱罡生物工程有限公司提供；逆转录试剂盒HiScript-ⅡQ RT SuperMix for qPCR（Vazyme）；PrimeScript ™ RT Reagent Kit（TaKaRa）；实验引物由上海桑尼生物科技有限公司合成、纯化；大鼠I 型及III 型COL 酶联免疫检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）。

3 实验方法

3.1 用携带绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的慢病毒转染人UC-MSCs 将成品UCMSCs 传代并扩增后，将细胞悬浮接种到24 孔板中，每孔均加入3.5×104个细胞，静置过夜。细胞覆盖率达到60%时，换液，加入针对不同的MOI值相对应的病毒量。病毒感染8 h 后换液，并继续培养48 h，最终病毒滴度为1×1011TU/L 的病毒颗粒。然后收集细胞用于后续实验。

3.2 静电纺丝三维纳米纤维支架的制备 SF/COL/PLCL 静电纺丝三维纳米纤维支架的制备过程如下［6-7］：将纯 SF 与 COL 按质量比为 70∶30 溶于六氟异丙醇（hexafluoroisopropanol，HFIP）中，得到8%的共混溶液，再将最佳配比的SF/COL 与PLCL｛PLLA［poly（L-lactide）］∶PCL［poly（caprolactone）］=75∶25｝分别按 100∶0、70∶30、50∶50、30∶70 和 0∶100 的质量比溶于HFIP 中，配制成8%的纺丝液，在电压为11 kV、接收距离12 cm、喷速1.5 mL/h 的条件下进行静电纺丝，电纺后的支架在真空干燥箱内充分干燥。

3.3 纳米纤维支架形貌表征观察与植入前后力学性能检测 （1）用扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM；HITACHI SU8010）观察纳米纤维支架纤维形态，通过分析软件测量纤维直径，计算其直径的分布范围和纤维的平均直径，分析SF/COL 与PLCL 不同比例对其纳米纤维直径的影响。（2）采用多功能材料力学实验机（MTS-Exceed-Model E42 及INSTRON-2716-020）对纳米纤维支架的植入前后不同时间段的力学性能进行评价。以10 mm/min 的加载速率对样品进行拉伸，直至完全拉断。经数据采集系统输出数据并绘制应力一形变量曲线，记录样品最大失效力（N）并计算杨氏模量（MPa）。

3.4 UC-MSCs 在纳米纤维支架上生长及增殖情况的检测 将慢病毒稳转UC-MSCs接种在三维纳米纤维支架上，UC-MSCs 接种后 5、7 和9 d 进行 SEM（Nova NanoSEM™ 450；Thermo Fisher Scientific）形态学观察，CCK-8法检测细胞增殖情况。

3.5 埋植实验 将12只SD 大鼠随机分为2组，10%水合氯醛300 mg/kg 麻醉后，仰卧位固定，腹部备皮消毒，切开腹侧壁约1 cm。实验组：将负载UCMSCs 的SF/COL/PLCL 补片植入大鼠腹部皮下；对照组：单纯SF/COL/PLCL 补片植入大鼠腹部皮下。用普里灵线缝合固定一针，可吸收线缝合切口。于术后1 周、4 周、12 周活体成像观察动态追踪移植细胞的存活、分布，并分别处死大鼠后对补片进行取材。

3.6组织病理学评价 将样品立即固定在4%多聚甲醛中，通过乙醇梯度脱水，清除并包埋在石蜡块中。使用切片机（LEICA）准备组织切片（4~5 µm），然后根据标准苏木精-伊红及Masson 三色方案进行染色，观察炎症细胞浸润及纤维化情况，腹部壁组织CD31 免疫组化染色标记检测新生血管。在1、4 和12 周组中对切片进行处理，通过光学显微镜半定量评估局部炎性细胞浸润、纤维化和新生血管情况。单个载玻片以0~4 评分。炎症评分：0 分为未见炎症细胞；1 分为每高倍镜视野（×400）可见1~10 个炎症细胞；2 分为每高倍镜视野（×400）可见10~30 个炎症细胞；3 分为明显浸润炎症细胞；4 分为可见形成包裹。纤维化评分：0 分为未见胶原纤维；1 分为可见局限的胶原纤维；2 分为可见中厚胶原纤维；3 分为可见厚胶原纤维；4分为可见广泛胶原纤维［8］。

HE 染色：将切片置于二甲苯中脱蜡，然后于无水乙醇中浸泡，最后自来水浸洗。将切片浸入苏木素染液染色5 min，水洗1 min，1%盐酸乙醇分化数秒，自来水中返蓝，将切片浸入伊红染液中染色3~5 min，再经梯度乙醇与二甲苯脱水透明，中性树胶封固，做好相关标记。

Masson 染色：将切片置于二甲苯中脱蜡，然后于无水乙醇中浸泡，最后自来水浸洗。将切片浸入37 ℃Bouin 液2 h，水洗至无黄色。天青石蓝染色液3 min；稍水洗；Mayer 苏木素染色液滴染 3 min；稍水洗；酸性乙醇分化液分化数秒；流水冲洗10 min；丽春红品红染液染10 min，蒸馏水稍冲洗；磷钼酸水溶液处理约10 min，直接用苯胺蓝液复染5 min、1%冰醋酸处理2 min，显微镜下观察染液的染色效果；再经梯度乙醇与二甲苯脱水透明，中性树胶封固，做好相关标记。

腹部壁组织CD31 免疫组织化学染色：切片二甲苯脱蜡，然后于无水乙醇中浸泡，最后PBS 浸洗。然后切片于 37 ℃、3% H2O2孵育 15 min，PBS 冲洗 3 次，每次3 min；置0.01 mmol/L 枸橼酸缓冲液（pH 6.0）中水煮修复10 min，自然冷却至室温，PBS 冲洗3 次，每次3 min；滴加Ⅰ抗，4 ℃冰箱孵育过夜，转至室温平衡 30 min，PBS 冲洗 3 次，每次 5 min；滴加Ⅱ抗，37 ℃孵育 30 min，PBS 冲洗 3 次，每次 5 min；DAB 反应染色，显微镜下观察反应进度，自来水充分冲洗；苏木素复染，干燥，封片，拍照；光学显微镜下观察。

3.7 RT-qPCR 检测白细胞介素2（interleukin-2，IL-2）、IL-6、IL-8 和肿瘤坏死因子 α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的表达量 两组大鼠于术后1、4 和12周，麻醉后处死，取出补片及周围组织。采用TRIzol试剂分离细胞的总RNA，依照说明书进行逆转录反应。以β-actin 为内参照，采用RT-qPCR 进行IL-2、IL-6、IL-8、TNF-α 和 β-actin 产物扩增及结果分析。RT-qPCR 条件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，共40个循环。引物序列见表1。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1. Sequences of the primers used for RT-qPCR

3.8 I 型及 III 型 COL 含量检测 移植后 1、4 和 12周不同时点每组大鼠补片样本均按照I 型及III 型COL ELISA 试剂盒说明书中方法处理，样品处理完毕后置于酶标仪（MD-SpectraMax Plus 384）中，设定检测波长为450 nm，测定吸光度，计算大鼠补片样本中 I 型 及 III 型 COL 浓 度 ，计 算 I 型 COL/III 型 COL比值。

4 统计学处理

应用SPSS 23.0 软件进行统计分析。使用Kolmogorov-Smirnov 法对每组数据进行正态分布检验，计量资料采用均数±标准差（mean±SD）表示。正态分布资料组间比较采用t检验及重复测量方差分析，非正态分布资料及等级资料采用非参数检验。定性资料采用率表示，组间比较采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 SF/COL/PLCL 纤维支架SEM表征和力学表征

SEM 图片显示，SF/COL/PLCL 纤维支架纤维的直径为（782.8±121.3）nm，成功制备了 SF/COL/PLCL 纤维支架，见图1。SF/COL/PLCL 纤维支架的拉力测试测得其拉伸断裂应力为（3.92±0.48）MPa，此时断裂伸长率为（56.53±15.72）%，拉伸弹性模量为（93.68±8.18）MPa，见图2。

2 接种纳米纤维支架不同时间后细胞的生长及增殖情况

Figure 1. SEM micrographs of SF/COL/PLCL at different magnifications.图1 SEM不同放大倍数观察最佳质量分数的SF/COL/PLCL 三维纳米纤维支架的表面形态

Figure 2. Stress-strain curves of SF/COL/PLCL fiber scaffolds.图2 SF/COL/PLCL 纤维支架的应力应变曲线

慢病毒转染的UC-MSCs 植入纳米纤维支架后，第5 天细胞形态正常，细胞结构正常，SEM 观察到UC-MSCs 在纳米纤维支架的外表面和网格内部有粘附生长，少量细胞聚集成片，呈不规则长形，细胞贴壁聚集且有细小空隙；第7 天细胞形态正常，细胞结构正常，延伸强，增殖能力明显增强，较第5 天细胞团增多，细胞贴壁聚集成片的有开裂空隙；到第9天，细胞增殖能力下降，细胞出现肿胀和结构断开，SEM 下可见更多的不规则网状细胞团，呈现细胞贴壁聚集成片的有开裂，边缘呈蛛网状，见图3。植入后以同时点的对照组存活率为100%相比，第5、7 和9 天的存活率分别为（137.98±4.53）%、（141.36±1.70）%和（85.92±2.12）%，差异有统计学意义（P＜0.01）。细胞活力在接种5 d 后增加，第9 天开始下降。

3组织病理学评估

HE染色显示单纯SF/COL/PLCL 补片组在第1周和第4 周显示出清晰的支架结构。随着时间的推移及炎症细胞浸润进展，局部组织肿胀坏死、凋亡、吞噬，支架慢慢降解，补片结构中间逐步形成空洞，到第12 周，支架中心区域不再可见，周围组织覆盖周边区域。在负载UC-MSCs 补片组中，纳米纤维膜在第1 周时仍然完好无损，但UC-MSCs 黏附于支架并已形成细胞层，且炎症细胞已显著浸润，见图4。

支架结构在第4 周完全分解，到第12 周，炎症细胞浸润已经消退，炎症细胞浸润评分较单纯SF/COL/PLCL 补片组无显著差异。Masson 和免疫组化染色显示，负载UC-MSCs 补片组与大鼠组织的整合表现较强；基于CD31标记的血管存在，支架已完全降解，被软组织取代，有广泛血管生成的证据。单纯SF/COL/PLCL 补片组与大鼠组织的整合较差，植入12周仍可见支架。与单纯SF/COL/PLCL 补片组相比，负载UC-MSCs 补片组显示出明显更多的CD31 标记的血管及更高程度的纤维化（P＜0.01）。见图5及表2。

表2 不同时点SF/COL/PLCL组和UC-MSCs+SF/COL/PLCL组的组织病理学评估Table 2. The semi-quantitative pathohistological assessment of the SF/COL/PLCL and UC-MSCs+SF/COL/PLCL groups at different time points after implantation（Mean±SD. n=5 to 6）

4 RT-qPCR 检测IL-2、IL-6、IL-8和TNF-α 的相对表达量

植入支架周围组织中 IL-2、IL-6、IL-8 和 TNF-α的相对水平随着时间的推移呈普遍下降趋势。与单纯SF/COL/PLCL 补片组相比，负载UC-MSCs 补片组在植入后1 和4 周时周围组织中的IL-6 水平略有升高，12 周时显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；但两组各时点IL-2、IL-8和TNF-α的表达水平差异无统计学意义（P＞0.05），见表3。

表3 植入后不同时点炎性细胞因子的相对表达水平Table 3. The relative expression levels of inflammatory cytokines at different time points after implantation（Mean±SD. n=4）

5 补片植入后的体内转归和力学性能

随时间增长，两组I 型COL/III 型COL 比值均增加。与单纯SF/COL/PLCL 补片组相比，负载UCMSCs组 I 型 COL/III 型 COL 比值增加更明显，差异有统计学意义（P＜0.01），见图6。

Figure 3. Scanning electron microscopic images showing the morphological changes of umbilical cord mesenchymal stem cells（UCMSCs）at different time points after implantated onto the nano-fibrous scaffolds. The red arrow indicates the loaded cells，and the cells delineated by the red border are further observed at×500 and ×2 500 magnification.图3 扫描电镜上不同放大倍数观察UC-MSC细胞接种到纳米纤维支架上不同时间点的细胞形态情况

Figure 4. Morphological observation of the scaffolds in each group at 1 week（HE staining，scale bar=25µm）.图4 1周时HE染色后两组支架的形态学观察

因第4 及12 周补片已降解，取第1 周的补片进行生物力学检测，记录样品最大失效力（N）并计算杨氏模量（MPa）。植入后1周，负载UC-MSCs补片组与单纯SF/COL/PLCL 补片组的最大载荷差异无统计学意义（P＞0.05），但负载UC-MSCs 补片组的弹性模量高于单纯SF/COL/PLCL 补片组，差异有统计学意义（P＜0.05），见图7。

讨 论

本研究显示SF/COL/PLCL 静电纺丝纳米纤维支架初始的拉伸断裂应力达到了（3.92±0.48）MPa，断裂伸长率为（56.53±15.72）%，拉伸弹性模量为（93.68±8.18）MPa，该支架起支持细胞黏附、实现力学支撑的作用。此外，以UC-MSCs 作为种子细胞构建组织工程补片，UC-MSCs 的形态在体外培养过程中保持稳定，在体外将UC-MSCs 细胞在接种纳米纤维支架后生长良好，接种支架7 d 时，细胞活力最强且细胞增殖能力最强，细胞形态，伸展较好且细胞结构致密，展现了良好的细胞相容性。

Figure 5. Pathohistological analysis of the naked and UC-MSCs+SF/COL/PLCL nano-membrane. The black arrow shows inflammatory cell infiltration，and the yellow arrow marks the position of the scaffold. Masson staining shows collagen fibers. CD31 immunohistochemical staining shows neovascularization.图5 12周时各组组织病理学染色分析

生物材料植入机体后往往会立即启动炎症反应，过强的炎症反应不仅导致局部组织肿胀坏死，同时还引起较强的纤维化，导致网片变形收缩，局部组织硬度增加，网片出现侵蚀等。本研究中负载UCMSCs 补片组1 周时组织学评分明显高于单纯SF/COL/PLCL 补片组，且镜下炎症细胞明显较多，但随着在体时间延长结构降解较快，12 周时负载UCMSCs 补片组受试位置补片已经降解，而大鼠活体成像显示负载UC-MSCs补片组随着在体时间延长体内分布更广，可能与组织相融合有关。因为此时组织可见大量胶原纤维及新生血管生成，组织纤维化评分及血管数负载UC-MSCs 补片组均明显高于单纯SF/COL/PLCL 补片组。随时间增长，两组Ⅰ型/Ⅲ型胶原蛋白比值均增长，负载UC-MSCs 补片组相对较快，而新生血管及胶原纤维大量增加有利于POP 患者盆底组织修复，并对器官起支撑作用。同时，较单纯SF/COL/PLCL 补片组，早期阶段（1 周、4 周）负载UC-MSCs 补片组的炎症因子水平 IL-6、IL-8 和 TNF-α相对增高，此与组织学观察到的炎性细胞的早期浸润要比单纯SF/COL/PLCL 补片组中更强表现一致，这可能与宿主对基质胶的降解和吸收的反应有关［9］。随着时间延长，可能由于UC-MSCs 发挥了免疫抑制能力，并且可以抑制刺激的淋巴细胞的增殖有关［10］，负载UC-MSCs 补片组下降速率相对较快。而及时终止炎症与血运重建早期发作是相互依存的［11］，早期高水平的炎症因子能够促进新生血管生成，如IL-6 是一种多功能细胞因子，Gopinathan等［12-15］研究显示，IL-6 可以直接刺激血管生成、诱导离体血管发芽、影响细胞增殖等，其与血管内皮生长因子相似的功效，但持续的炎症过程血管生成发育明显滞后，如IL-6 的高水平会造成总生存期下降［16］，而MSCs因具有一定的免疫调节功能，影响局部炎症微环境，使得负载UC-MSCs补片组新生血管生成后，炎症因子及时终止，避免了过强的炎症反应和过强的纤维化带来的损害。UC-MSCs 还能分泌多种神经元相关的生长因子，例如营养介质，有助于组织修复［17-18］。

Figure 6. The ratio of collagen type I to collagen type III at different time points in each group. Mean±SD. n=6.**P＜0.01 vs SF/COL/PLCL group图6 各组别不同时点Ⅰ型/Ⅲ型胶原蛋白比值

Figure 7. The maximum load（A）and elastic modulus（B）of synthetic implants for pelvic reconstructive surgery.Mean±SD. n=4.*P＜0.05 vs SF/COL/PLCL group.图7 两组补片在体最大载荷和弹性模量

进一步研究表明，植入大鼠后1 周，负载UCMSCs 补片组与单纯补片组的最大载荷无明显差异，但负载UC-MSCs 补片组的弹性模量较高。可见UCMSCs 可改善组织工程支架的生物力学性能，使其具有更强顺应性和韧性，避免网片变形收缩。

本研究结果发现，负载UC-MSCs 的SF/COL/PLCL 静电纺丝纳米纤维支架展现了良好的细胞相容性，更强顺应性和韧性，及良好的抗炎性和组织修复能力，可满足盆底重建要求，具有良好应用前景。