地塞米松联合归脾汤通过调控巨噬细胞极化平衡缓解免疫性血小板减少症*

郑兵荣， 胡莲波， 杨 阳， 陈春梅， 成 志， 胡美薇

（浙江中医药大学附属第二医院血液科，浙江 杭州 310005）

免疫性血小板减少症（immune thrombocytopenia，ITP）是一种自身免疫异常导致的血液系疾病，以皮肤、黏膜出血和外周血小板减少为主要表现，部分患者可出现颅内出血，危及生命［1-3］。除了出血症状之外，疲劳乏力是ITP 较为突出的临床表现之一［4-6］。目前，临床上常用的治疗方案包括糖皮质激素、促血小板生成素及其他免疫抑制剂等，但ITP 具有易反复发作、治疗难度大、治疗效果不佳及长期服用西药副作用不能耐受等特征［7-9］。因此，近年来传统中药在治疗ITP 方面大力发展，临床疗效显著，且副作用小［10-11］。中医学理论认为ITP 主要分气虚型、阴虚型和火热妄型。归脾汤（Guipi decoction，GPD）具有益气生血摄血、养血安神等功效，从中医理论上可减轻气虚型ITP 的症状［12-14］。多年来我科开展ITP的中医治疗，通过GPD 加减联合激素或促血小板生成素治疗气虚型ITP 病人100 余例，疗效肯定。本项工作拟探讨GPD 可否通过调控核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信号通路诱导巨噬细胞M2 极化，为GPD在临床上防治气虚型ITP提供参考资料。

材料和方法

1 诊断标准

西医ITP 诊断标准：参考“成人原发免疫性血小板减少症诊断与治疗中国专家共识（2016 年版）”。中医诊断标准：参照国家中医药管理局2010 年中医血液病重点专科紫癜病（免疫性血小板减少症）。中医诊疗方案中医证候辨证为气虚不摄型ITP：主症2项+次症2 项+舌脉。（1）主症：紫斑，色紫暗淡，反复发作，多呈散在性，劳则加重。（2）次症：头晕疲乏、面色少华；心悸气短、四肢倦怠、胃纳欠佳；鼻衄、齿衄。（3）舌象：舌淡，苔白。（4）脉象：脉细弱。

2 纳入标准

（1）血小板＜30×109/L；（2）至少2 次血常规检查示血小板计数减少，血细胞形态无异常；（3）脾脏不增大；（4）骨髓检查：巨核细胞数增多或正常、有成熟障碍；（5）排除其他继发性血小板减少症；（6）主症2项+次症2 项+舌脉；（7）治疗前至少两周未接受过大剂量糖皮质激素冲击治疗的患者；（8）知情同意自愿加入本项目研究者。

3 排除标准

（1）其他疾病继发的血小板减少需排除出研究范围；（2）有重要脏器严重损伤者；（3）精神性疾病或妊娠及哺乳期妇女；（4）严重出血如颅内出血者；（5）过敏体质或已知对受试药物（单味）过敏者；（6）不合作者，如精神病患者及依从性差且不愿服用中药者。

4 剔除标准

（1）治疗期间出现严重不良反应的病人；（2）治疗期间发现其他血液系统疾病的病人；（3）治疗期间出现严重并发症危及生命而必须终止的病人；（4）病人依从性差，不按医嘱用药，临床疗效无法评估者；（5）各种原因致使临床资料不全，无法统计者。

5 一般材料

经浙江中医药大学附属第二医院伦理委员会批准（No. 2020-KL-105-01），所有受检者均知情同意。选择2018 年9 月至2020 年6 月在浙江中医药大学附属第二医院血液科就诊的气虚型原发性ITP 患者64例，按照随机分组：32 例地塞米松（dexamethasone，Dex）治疗组和32例Dex+GPD 联合治疗组；另以同期健康体检者30 例为对照组。排除血小板数量异常及功能异常等疾病，各组对象在年龄和性别构成上差异无统计学意义。

6 药物治疗

Dex组：根据“成人原发免疫性血小板减少症诊断与治疗中国专家共识（2016年版）”一线治疗方案，使用Dex 磷酸钠注射液（由天津金耀集团湖北天药药业股份有限公司生产，规格5 mg∶1 mL），40 mg/d，连用4 d。GPD 联合西医治疗：在Dex 治疗基础上给予 GPD 加减治疗：黄芪 30 g，白术15 g，党参12 g，当归12 g，炙甘草12 g，远志10 g，茯神12 g，酸枣仁9 g，广木香9 g，龙眼肉9 g，生姜3 g，大枣10 g（中药材均来源于本院药房）。中药方剂嘱患者日一剂，水煎服，每次200 mL，每天2 次；或选用中药颗粒剂，日一剂，每次沸水冲至150 mL，每天2 次。2 周为1 疗程，连续服用1到2个疗程。

7 主要试剂及仪器

人白细胞介素10（interleukin-10，IL-10）ELISA试剂盒（1111002）、人IL-12 ELISA 试剂盒（1111202）和人肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA 试剂盒（1117202）均购自达科为生物技术有限公司；人干扰素γ（interferon-γ，IFN-γ）ELISA 试剂盒（ml057425）购自上海酶联生物技术有限公司；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS；L2654）购自Sigma；人重组IL-4（P05112）购自上海近岸生物科技有限公司；人重组 IFN-γ（AF-300-02）购自 PeproTech；Ficoll®Paque Plus 淋巴细胞分离液（17-1440-02）购自GE Healthcare；CD14+细胞分选磁珠（130-118-906）购自 Miltenyi Biotec；佛波酯（phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA；P6741）购自北京索莱宝科技有限公司；PE 标记的 CD206 抗体（321106）和 PE 标记的CD80 抗体（375410）均购自 BioLegend。吲哚胺 2，3双加氧酶（indoleamine 2，3-dioxygenase，IDO）抗体（8630）、p65 抗体（8242）、p-p65 抗体抗体（3033）和GAPDH 抗体（5174）均购自 Cell Signaling Technology。

XE-5000 全自动血细胞分析仪及原装配套试剂（Sysmex）；冷冻台式离心机（Thermo）；Western blot 全套系统（Bio-Rad）；FACSCanto II流式细胞仪（BD）；倒置显微镜（Leica）。

8 指标观察及检测方法

8.1 血标本的采集及处理 采集所有ITP患者和健康者静脉血10 mL 于真空采血管中。应用Sysmex XE-5000全自动血细胞分析仪检测血常规，记录血小板计数；300×g离心10min，收集各组血清；使用Ficoll分离液400×g离心30 min，吸取中间外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC）层。

8.2 CD14+细胞分选及诱导 PBS 清洗PBMC，4 ℃进行CD14 磁珠旋转孵育15 min，磁力架分选后洗脱的即为CD14+单核细胞。加入PMA 诱导为M0 巨噬细胞，并分别用 LPS+IFN-γ 或 IL-4 诱导为 M1 和 M2型巨噬细胞。

8.3 流式细胞术检测 取诱导后的各组细胞置于流式管内。IL-4 诱导组细胞用PE 标记的CD206 抗体孵育，LPS+IFN-γ诱导组细胞用PE标记的CD80抗体孵育，用BD FACSCanto II 流式细胞仪检测M1 和M2型巨噬细胞指标，用FlowJo软件整理数据。

8.4 ELISA 检测 收集各组血清标本，按照ELISA试剂盒说明书进行TNF-α、IFN-γ 和 5-羟色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）的检测；收集单核细胞诱导后的各组细胞培养上清，按照ELISA 试剂盒说明书进行IL-10和IL-12的检测。

8.5 Western blot 检测 各处理组细胞，加入RIPA裂解液，静置、离心、取上清，以BCA 法测蛋白浓度，加上样缓冲液，煮沸5 min变性后行SDS-PAGE（浓缩胶层用80 V，20 min；分离胶层用120 V，1 h）；电泳后300 mA 恒流转至PVDF 膜，室温脱脂奶粉封闭2 h，洗膜3 次，加入Ⅰ抗（目的蛋白按1∶1 000 稀释，GAPDH 按1∶5 000 稀释）4 ℃冰箱孵育过夜，洗膜3次，加Ⅱ抗（按1∶5 000 稀释）孵育1 h，洗膜3 次，ECL化学发光后暗室胶片显影。

9 统计学分析

用SPSS 22.0 软件进行统计分析，用GraphPad Prism 7 软件作图。结果以均数±标准差（mean±SD）表示。多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 不同治疗方案对ITP患者血小板计数的影响

与初诊ITP组比较，Dex治疗组和Dex+GPD 联合治疗组的血小板计数均显著升高（P＜0.05）；与Dex治疗组比较，Dex+GPD 联合治疗组的血小板计数亦显著升高（P＜0.05），见图1。

Figure 1. The effect of dexamethasone（Dex）and Guipi decoction（GPD）combined with Dex on platelet（PLT）count in the blood of immune thrombocytopenia（ITP）patients. Mean±SD.*P＜0.05 vs ITP group；#P＜0.05 vs Dex group.图1 各组血小板计数结果

2 不同治疗方案对ITP 患者血清中各细胞因子表达的影响

与初诊ITP组比较，Dex治疗组和Dex+GPD 联合治疗组血清5-HT 水平均显著升高（P＜0.05），TNF-α和IFN-γ水平均显著降低（P＜0.05）；与Dex治疗组比较，Dex+GPD 联合治疗组血清5-HT 水平均显著升高（P＜0.05），TNF-α 和 IFN-γ 水平均显著降低（P＜0.05），见图2。

3 不同治疗方案对巨噬细胞极化的影响

Figure 2. The effects of dexamethasone（Dex）and Guipi decoction（GPD）combined with Dex on serum cytokine levels in immune thrombocytopenia（ITP）patients. A：serum tumor necrosis factor-α（TNF-α）concentration；B：serum interferon-γ（IFN-γ）concentration；C：serum 5-hydroxytryptamine（5-HT）concentration. Mean±SD.*P＜0.05 vs ITP group；#P＜0.05 vs Dex group.图2 各组血清中细胞因子水平的比较

与初诊ITP组比较，Dex治疗组和Dex+GPD 联合治疗组巨噬细胞的CD206 表达水平均显著升高（P＜0.05），CD80 表达水平均显著降低（P＜0.05）；与Dex治疗组比较，Dex+GPD 联合治疗组巨噬细胞的CD206 表达水平均显著升高（P＜0.05），CD80 表达水平均显著降低（P＜0.05），见图3A、B。与初诊ITP组比较，Dex 治疗组和Dex+GPD 联合治疗组巨噬细胞培养上清液中的IL-10 浓度均显著升高（P＜0.05），IL-12 浓度均显著降低（P＜0.05）；与 Dex 治疗组比较，Dex+GPD 联合治疗组巨噬细胞培养上清液中的IL-10 浓度均显著升高（P＜0.05），IL-12 浓度均显著降低（P＜0.05），见图3C、D。

4 各组p65和IDO蛋白表达及p-p65水平的比较

与初诊ITP组比较，Dex治疗组和Dex+GPD 联合治疗组巨噬细胞的IDO 和p-p65 蛋白水平均显著降低（P＜0.05）；与Dex 治疗组比较，Dex+GPD 联合治疗组巨噬细胞的IDO和p-p65蛋白水平均显著降低（P＜0.05），见图4。

讨 论

新诊断ITP的治疗目标是获得更好的反应、长期维持缓解并最大限度地减少出血。此外，必须权衡治疗的益处与其潜在风险。多年来，美国血液学会的指南一直建议将较长疗程的皮质类固醇作为一线标准治疗。与Dex 单药治疗相比，利妥昔单抗联合治疗可提高长期持续缓解率，此外联合治疗在观察早期显示出更好的调节性T 细胞（regulatory T cells，Treg）上调效果。然而，Dex 联合利妥昔单抗仍不能降低成人ITP的复发率。因此，仍需新的治疗策略来更好低改善ITP患者预后。

ITP根据其临床表现属中医“紫斑”、“血证”、“衄血”、“发斑”等范畴，于2008 年的“常见血液病中医病名专题讨论会”上定名为“紫癜病”［16］。《中医内科学》将血证（紫斑）分为三种证型：血热妄行、阴虚火旺、气不摄血。有研究认为，纯虚类证型出现频次居于各类证型之首，虚损涉及气、血、阴、阳、肝、脾、肾，其中涉及到气虚证型的频次较高，提示ITP虚损是以气虚为主［17］。其中疲劳乏力是气虚型ITP 较为突出的表现之一。Dex 可在几天到几周后显示出初步效果，然而皮质类固醇相关并发症限制了其长期作用和疗效。因此，越来越多的关于与二线药物联合方案的研究旨在提高疗效并获得长期缓解。

本院血液科对ITP进行了系统和深入的研究，根据中医学理论结合多年临床实践总结，针对气虚型ITP 患者采用Dex+GPD 联合治疗。我们的结果显示，Dex+GPD联合治疗具有显著临床效果。

Figure 3. The effects of dexamethasone（Dex）and Guipi decoction（GPD）combined with Dex on the polarization of the macrophages from immune thrombocytopenia（ITP）patients. A：the expression of CD206 in peripheral blood mononuclear cells detected by flow cytometry；B：the expression of CD80 in peripheral blood mononuclear cells detected by flow cytometry；C：the concentration of interleukin（IL）-10 in the cell culture supernatant detected by ELISA；D：the concentration of IL-12 in the cell culture supernatant detected by ELISA. MFI：mean fluorescence intensity. Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs ITP group；#P＜0.05 vs Dex group.图3 各组巨噬细胞极化的诱导

Figure 4. The effects of dexamethasone（Dex）and Guipi decoction（GPD）combined with Dex on the protein levels of nuclear factorκB（NF-κB）p65，p-p65 and indoleamine 2，3-dioxygenase（IDO）in the macrophages from immune thrombocytopenia（ITP）patients were detected by Western blot. Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs ITP group；#P＜0.05 vs Dex group.图4 各组p-p65和IDO的Western blot检测结果

越来越多的证据表明，ITP 期间的主要问题是效应子和调节性免疫细胞之间的不平衡相互作用。例如Th1/Th2 细胞、树突状细胞（dendritic cells，DC）和Treg 等的比例失调，导致免疫耐受性扭曲，免疫细胞清除血小板增加，以及血小板生成受损。虽然尚不完全清楚针对血小板抗原的自身抗体是如何产生的，但它们对血小板清除和产生的影响现已完全阐明。Treg和DC之间的相互作用在ITP中受抑制。由于ITP 患者中的Treg 水平较低，这导致DC 的免疫调节酶IDO1 表达降低，并且可以向其他免疫细胞呈递（自身）抗原的成熟DC 水平增加。另一项研究进一步表明了DC 在ITP 中诱导耐受的重要作用，其中静脉输注免疫球蛋白在鼠模型中通过DC 介导其作用。巨噬细胞在适应性免疫和先天免疫中都发挥重要作用，它们在响应不同的环境刺激时会分化为经典激活的M1型或交替激活的M2型［18-19］。巨噬细胞的M1极化具有促炎作用，而M2 极化具有免疫抑制作用［20］。M2 型巨噬细胞的免疫抑制作用是增加IL-10的产生和抑制IL-12 和TNF-α 的表达，进而影响ITP的发展［21］。NF-κB 信号转导通路作为炎症反应的重要靶点，已成为分子生物学中广泛研究的转录调控系统。大多数研究报道，NF-κB 通路可能导致自身免疫性疾病，包括类风湿性关节炎、免疫性血小板减少症、系统性红斑狼疮、炎症性肠病和银屑病等［22-23］。Ji 等［24］研究显示，NF-κB 可以控制 T 细胞的发育，同时与ITP 中的T 细胞耐受相关。此外有文章报道了NF-κB 在巨噬细胞极化中的作用，为本研究提供了一些思路［25-26］。针对气虚型ITP 患者采用Dex+GPD联合治疗，可调控巨噬细胞的极化平衡。

本实验收集64 例初诊气虚型ITP 患者，随机分成Dex组和Dex+GPD 联合治疗组。通过血细胞分析仪显示两组治疗均能够升高血小板数量，且Dex+GPD 联合治疗组效果更为显著；同时Dex+GPD 联合治疗能更明显降低血清TNF-α和IFN-γ水平，升高5-HT 水平。流式细胞术检测巨噬细胞表型显示，Dex+GPD 治疗更易促进M2型极化指标CD206的上调，同时抑制M1 型极化指标CD80 的下调，p-p65 蛋白水平下调。这些结果提示GPD 能够调节巨噬细胞极化，有效恢复气虚型ITP血小板的数量。

综上所述，GPD 联合西医治疗可以有效改善气虚型ITP 的临床进程，其可能机制是通过抑制NF-κB信号通路的激活，促进巨噬细胞M2 极化，增加IL-10和 5-HT 的产生，抑制 IL-12 及 TNF-α 的表达。本研究为临床治疗气虚型ITP提供了参考资料。