基于高光谱成像的大豆叶片叶绿素分布可视化

李胜利

(修武县农业技术推广中心， 河南 修武 454350)

0 引言

【研究意义】叶绿素是大豆叶片进行光合作用时吸收利用光能的主要物质，叶绿素含量的高低直接影响大豆叶片光合能力、光合产物积累和最终产量的形成，可以作为大豆养分水平和生长发育状况的指示器[1-2]。传统的叶绿素含量测定方法有实验室试剂法和叶绿素仪测定法，实验室试剂法一般耗时耗力，且对样本具有一定的破坏性[3]。叶绿素仪测定法虽测定简单，但只能测定叶片上某个点的叶绿素相对值[4]。对大豆叶绿素含量进行准确、实时和无损伤监测，以精确掌握大豆养分水平和生长发育状况，实现大豆生长过程的合理施肥和精准管理意义重大。【前人研究进展】近年来，因高光谱成像技术集合光谱与图像二者的优势，同时包含被测物体一维的高光谱反射信息和二维的空间位置信息，高光谱技术与成像技术结合，为高光谱探测目标的图像分类与定量估测模型的构建与代入提供条件[5-7]。基于高光谱成像技术和不同的图像分类方法，在烟叶与杂物的分类识别[8]、不同花生品种分类[9]和牧草种类识别[10]等方面获得较好效果。利用作物的光谱反射特性，孙红等[11]选用马铃薯叶片的高光谱成像数据中382～1 019 nm波段作为研究波段，利用随机蛙跳算法和偏最小二乘法，选择敏感波段并构建马铃薯叶片叶绿素含量估测模型。丁希斌等[12]采用高光谱成像技术预测了油菜叶片的叶绿素含量，相关系数达0.834。作物生长参数估测模型代入高光谱成像数据实现含量分布可视化方面，前人已经在作物受病害程度、叶片水分含量和叶绿素含量等方面进行研究，通过伪彩色处理技术，对作物生长参数分布具有较直观的展示[4,13-14]。大豆作为主要的粮油作物，基于光谱分析技术对大豆叶片叶绿素含量的无损监测研究较少。孔维平等[15]利用便携式叶绿素测定仪和FieldSpec 3地物光谱仪(350～1 000 nm)对大豆叶片叶绿素含量进行估测，且估测模型具有较高的精度和良好的预测能力。宋开山等[16]测定大豆冠层反射光谱和叶绿素数据，使用不同建模方法对叶绿素含量进行估测发现，基于小波分析的回归模型具有较好的估测效果。【研究切入点】大豆叶片叶绿素含量多数研究是基于便携式光谱仪采集的数据，并未使用高光谱成像技术采集数据，不能实现大豆叶绿素含量、元素营养水平和生长发育状况差异性的直观展示。【拟解决的关键问题】选择叶绿素含量具有代表性的大豆叶片，采集其高光谱成像数据和叶绿素含量值，通过形式简单、稳定性强和具有生理生化意义的植被指数作为光谱变量构建大豆叶片叶绿素含量估测模型，结合大豆叶片高光谱成像数据，计算高光谱图像上每一像素点的叶绿素含量值，利用伪彩色图像处理技术绘制大豆叶片叶绿素含量分布图，为直观监测大田的大豆冠层元素营养水平和生长发育状况提供新的技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

大豆品种为黄淮海地区常见品种齐黄34，种子来源于山东省农业科学院。

1.2 大豆栽培与叶片采摘

大豆于2020年6月播种于河南省修武县农技推广中心大豆示范中心，按照当地种植习惯进行田间管理，保证大豆样本与当地正常大豆植株生长水平一致。在大豆初花期和鼓粒期，肉眼观察大豆叶片叶色和发育程度，采摘叶色和发育程度差异较大的大豆叶片，为避免叶片失水采摘后立即放入冷藏盒中，带回实验室进行高光谱图像信息及叶绿素含量的采集与测定。

1.3 测定项目及方法

1.3.1 大豆叶片高光谱图像信息采集 利用Pika XC高光谱成像系统进行高光谱图像信息采集，该系统主要由电控位移平台、高光谱相机、光源、标准白板和计算机等部件组成，结构如图1所示。高光谱相机的光

图1 高光谱成像系统

谱分辨率为2.8 nm，采样间隔为1.6 nm，光谱为400～1 000 nm，通过线性扫描的方式进行高光谱图像信息采集。首先开启系统和光源，预热20 min，以消除基线漂移的影响，调整相机镜头与电控位移平台的垂直距离约为45 cm。然后通过软件加载高光谱相机与电控位移平台，调整平台位置，使镜头对准样本扫描初始位置，进行曝光、暗电流采集、白板校正和图像宽高比调节等工作。最后对大豆叶片进行高光谱成像数据采集，每次采集完成后均需重新进行标准白板校正，利用公式(1)计算大豆叶片的高光谱成像数据。

(1)

式中，Iraw为样本叶片未经校正的高光谱数据，Iwhite为白板数据，Idark为暗电流数据，R为校正过后的大豆叶片高光谱成像数据。

1.3.2 大豆叶片叶绿素含量 大豆叶片叶绿素含量测定参考张宪政[17]的方法，大豆叶片高光谱成像数据采集完成后，立即使用直径为1.5 cm的打孔器在主叶脉两侧两孔并称量孔重，剪为细丝状后放入20 mL 80%丙酮溶液中，在20℃下黑暗浸提1 d，直至大豆叶片叶色完全变白，测定溶液在663 nm和645 nm处的光密度，利用计算公式(2)和(3)计算的叶绿素含量作为该大豆叶片样本的叶绿素含量。

Chlt=20.21A645+8.02A663

(2)

(3)

式中，A663和A645分别表示波长663 nm和645 nm的吸光度，Chlt表示叶绿素浓度(mg/L)，C表示叶绿素质量浓度(mg/L)，V表示提取液的体积(mL)，W表示叶片重(g)，LCC(mg/L)表示叶片叶绿素浓度。

1.4 数据处理

1.4.1 训练集与预测集的选择 采用浓度梯度法[18]在大豆叶片总样本中，按叶绿素含量高低顺序排列，每隔3个样本抽取1个大豆叶片样本作为预测集，剩余大豆叶片样本作为训练集。

1.4.2 大豆叶片高光谱反射率的获取 大豆叶片样本进行高光谱成像数据采集完成后，在ENVI 5.3中以整张大豆叶片作为感兴趣区域(Region Of Interest，ROI)，对ROI上每一像素点上的反射光谱进行平均处理，作为该大豆叶片样本的反射光谱。

1.4.3 植被指数 植被指数作物高光谱遥感估测模型中最常用的光谱参量，其特质为形式简单、稳定性强和具有一定的生理生化意义。如表1所示，一是引用前人研究中与叶绿素含量相关性较强的植被指数；二是构建400～1 000 nm内各波段光谱反射率两两自由组合的差值植被指数(Difference Vegetation Index，DVI)、比值植被指数(Ratio Vegetation Index，RVI)和归一化植被指数

表1 植被指数的计算公式

(Normalized Difference Vegetation Index，NDVI)，计算构建的自由组合植被指数与叶绿素含量的相关性，通过二者相关性的强弱确定所需要的自由组合植被指数。3种自由组合植被指数的计算公式如下：

DVI(i,j)=Ri+Rj

(4)

(5)

(6)

式中，R表示原始光谱反射率或一阶导数光谱值，i和j表示波长(nm)，Ri和Rj表示在波长i或j波长的原始光谱反射率或一阶导数光谱值。

1.4.4 估测模型的构建与检验 通过训练集样本数据构建大豆叶片叶绿素含量估测模型，并利用预测集样本数据对估测模型进行精度评价。通过引用前人植被指数(表1)与自由组合植被指数分别和叶绿素含量进行相关性分析，根据相关性的大小参与叶绿素含量估测模型的构建，主要以线性和二次回归方程对植被指数和叶绿素含量进行拟合，拟合方程如下：

线性函数：y=αx+b

二次函数：y=αx2+bx+c

对估测模型优劣的评价指标主要有决定系数R2(Determination Coefficients)和均方根误差RMSE(Root Mean Square Errors)，其中训练集和预测集的决定系数分别为R2c和R2p。R2的值介于0～1，当R2的值越接近1且RMSE越接近0时，表明模型的预测效果越佳，精度越高。R2和RMSE计算公式如下：

(7)

(8)

式中，yi代表预测值，yj代表实测值，n代表样本数。

1.4.5 大豆叶片叶绿素含量可视化分布 大豆叶片叶绿素含量分布可视化的原理是利用高光谱成像数据和含量估测模型实现叶绿素含量在对应空间位置的数字化显示，主要包括目标样本图像分割和含量可视化两部分。

1) 目标对象图像分割。目标样本图像分割是将高光谱成像数据中大豆叶片与背景的光谱信息与空间信息进行分割，获得只包含大豆叶片的信息。在ENVI 5.3中利用支持向量机技术，以大豆叶片与背景的光谱特征不同作为支持向量机技术的分类标准，输出二者的分类结果，然后通过矢量变换和掩模等步骤输出只包含大豆叶片的高光谱成像数据。

2) 含量可视化。通过大豆叶片叶绿素含量估测模型和高光谱成像数据，计算大豆叶片高光谱图像上每个像素点的叶绿素含量值，此时大豆叶片高光谱图像变换为含位置信息的叶绿素含量分布灰度图，按灰度图各位置的灰度值进行伪彩色处理，最终获得叶绿素在大豆叶片上的含量可视化分布图。

2 结果与分析

2.1 训练集与预测集的叶绿素含量分布

由表2可见，训练集和预测集中大豆叶片的叶绿素平均含量分别为2.513 mg/g和 2.591 mg/g，变异系数分别为31.8%和30.6%。

表2 训练集与预测集的叶绿素含量分布

2.2 大豆叶片反射光谱曲线

由图2可见，由于叶绿素的强反射作用，在540 nm左右的绿光范围形成“绿峰”；叶绿素对670 nm左右的红光具有强吸收作用，形成“红谷”；叶绿素对红光强吸收和叶片复杂结构对近红外光的多次强反射，导致在波长680～760 nm内产生1条反射率急剧上升的斜边，称为红边。大豆叶片反射光谱中的绿峰、红谷和高反射率平台的反射率值和红边的波段位置差异显著，表明选择的训练集样本具有良好的代表性，可以进行大豆叶片叶绿素含量的高光谱估测研究。

图2 大豆样本叶片的反射光谱曲线

大豆叶片样本按叶绿素含量(0.919～4.125 mg/g)的高低顺序分为4组:0.919～1.720 mg/g、1.720～2.522 mg/g、2.522～3.323 mg/g和3.323～4.125 mg/g，进行平均处理获得不同叶绿素含量的大豆叶片反射光谱曲线(图3)，随着大豆叶片叶绿素含量的增加，“绿峰”反射率值下降明显，680～760 nm的红边位置明显向长波方向移动，但高反射率平台的反射率无显著变化规律。

图3 不同含量叶绿素的大豆叶片反射光谱曲线

2.3 大豆叶片叶绿素含量与反射光谱的关系

2.3.1 与反射光谱的相关性 如图4所示，叶绿素含量与光谱反射率在各波段的相关性大小和显著性不同，在400～424 nm和743～1 000 nm呈正相关，与425～742 nm呈负相关，二者在474～734 nm呈显著负相关水平(P<0.05)，在486～731 nm呈极显著负相关水平(P<0.01)，相关性最强的波段位于700 nm(r=-0.879)。

图4 大豆叶片光谱反射率与叶绿素含量的相关性

2.3.2 与植被指数的相关性 如图5所示，400～1 000 nm波段自由组合形成的DVI、RVI和NDVI与叶绿素含量间的相关系数具有沿对角线对称分布的特点；3种自由组合形成的植被指数与叶绿素含量相关性强的光谱波段主要在490～760 nm的可见光区域，尤其分布在绿光(492～577 nm)和红光(622～760 nm)范围内。

注：每个像素点的色度值代表构建的植被指数与大豆叶片叶绿素含量相关系数的大小。

如表3所示，现叶绿素含量与植被指数的相关性均达极显著水平(P<0.01)，引用的植被指数中PSRI与叶绿素含量的相关性最差(r=0.336)，m NDI与叶绿素含量的相关性最优(r=0.905)，3种自由组合植被指数与叶绿素含量的相关系数均在0.9以上，其中RVI (968,698)与叶绿素含量的相关性最好(r=0.923)。

表3 大豆叶片叶绿素含量与植被指数的相关性

2.4 大豆叶片叶绿素含量估测模型的构建与检验

表4 基于植被指数的大豆叶绿素含量估测模型

2.5 大豆叶片叶绿素含量的可视化

如图6所示，叶绿素含量由下向上逐渐上升；由大豆叶片上不同颜色可知，成熟健康的大豆叶片中，叶绿素主要分布在叶脉两侧，叶绿素含量较高，在叶片边缘和基部叶绿素含量较低，在衰老或损伤的叶片中，叶绿素主要集中在叶片未失绿的位置，在叶片失绿的位置含量较低。表明，基于高光谱成像技术的大豆叶片叶绿素含量可视化的分布情况符合事实规律，大豆叶片叶绿素含量分布可视化效果较好。

注：A为大豆叶片高光谱图像，B为大豆叶片与背景分割图像，C为大豆叶片叶绿素含量分布可视化图像；右侧色度条中不同颜色对应不同的叶绿素含量，随着数值增大色度条颜色由蓝色渐变为红色。

3 讨论

作物叶片反射光谱特征包括蓝谷、红谷、绿峰、高反射率平台、红边和红边位置等，主要受到叶片叶绿素含量、水分含量和叶片结构等因素综合影响[24-25]。该研究中随着大豆叶片叶绿素含量的增加，“绿峰”反射率明显下降，红边位置发生“红移”，表明叶绿素对可见光具有强吸收作用，高反射率平台反射率并没有发生明显有规律的变化，高反射率平台的差异主要与叶片细胞结构、叶片厚度和内部组织有关，表明叶片叶绿素含量与叶片结构之间没有明显联系[26-29]。该研究中直接对原始光谱反射率和叶绿素含量进行相关性分析，并未对原始反射光谱进行预处理变换，前人研究表明，对原始反射光谱进行预处理变换，如一阶导数变换、连续小波变换、标准正太变量变换和移动平均法等光谱预处理方法，可以减弱外界因素的干扰并增强光谱反射特征[30-31]。

大豆叶片叶绿素含量与植被指数相关性分析发现，叶绿素含量与波段反射率自由组合植被指数的相关性优于引用的前人植被指数[19-23]，可能因为植被指数具有明显的时效性和空间差异性，受环境、作物种类和观测尺度等因素影响，所以基于自身反射光谱数据构建的植被指数与叶绿素含量的相关性更强[32]。该研究采用植被指数作为光谱参量通过线性和二次方程构建叶绿素含量估测模型表明，其他光谱参量如光谱面积和红边位置等，与作物农学参数含量、生理参数和产量品质之间同样具有较强的相关性，红边位置的“红移”和“蓝移”也常用作估测作物的氮素营养水平[33-34]。另有研究表明，采用逐步回归、偏最小二乘和神经网络等建模方法的建模效果优于简单的线性和二次方程建模方法[35-36]。

该研究中，基于大豆叶片高光谱图像和叶绿素含量估测模型，基本实现叶绿素在大豆叶片上含量可视化分布，可以较为直观的反映叶绿素在大豆叶片分布情况。在叶片某些区域叶绿素含量的可视化分布情况不合理，这主要由于大豆叶片表面不平整，造成叶片不同位置距离镜头的距离不一致，当光源照射后，这些位置存在模糊、过曝和阴影等问题，导致不同位置的光谱反射率有差异或失真。另外，大豆叶片不同位置的内部结构和化学成分不同，可在对应的反射光谱中体现，因而通过估测模型预测的叶绿素含量具有差异。该研究是在叶片观测水平对大豆进行叶绿素含量的进行可视化研究，虽在较高的冠层尺度、无人机尺度和卫星尺度的观测尺度下的大豆叶绿素含量可视化研究更具有实际意义，但叶片尺度上的可视化研究可为其他尺度的研究提供方法和思路。后续还需在其他生态点、更多品种和不同尺度进行试验，利用多种光谱变量和建模方法完善改进大豆叶片叶绿素含量估测模型，以期提高预测精度、增强普适性和实现跨尺度叶绿素含量估测。对基于高光谱成像数据的大豆叶片叶绿素含量分布可视化的步骤进一步优化，实现效果更优的叶绿素含量分布可视化视觉表达。

4 结论