淫羊藿苷元的肠道跨膜转运机制研究

慈小燕，孙英辉，武卫党，曾 勇，刘昌孝，伊秀林*，闫凤英*

淫羊藿苷元的肠道跨膜转运机制研究

慈小燕1, 2, 3，孙英辉1, 2，武卫党1, 2，曾 勇1, 2，刘昌孝1, 2，伊秀林1, 2*，闫凤英1, 2, 3*

1.天津药物研究院 释药技术与药代国家重点实验室，天津 300462 2.中国医学科学院 药物代谢新技术创新单元，北京 100730 3.天津和创生物技术有限公司，天津 300301

探讨淫羊藿苷元（icaritin，ICT）在肠道内的转运机制，并阐明ICT生物利用度低的主要原因。采用体外细胞模型人结肠癌Caco-2细胞及小肠癌LS-180细胞和人药物转运蛋白细胞系 [P-糖蛋白（P-glycolprotein，P-gp，又名MDR1）、乳腺癌耐药蛋白（breast cancer resistance protein，BCRP）和多药耐药相关蛋白2（multidrug resistance-associated protein 2，MRP2）过表达的狗肾细胞系MDCK-MDR1、MDCK-BCRP、MDCK-MRP2及空白转染的狗肾细胞系MDCK-mock；有机阴离子转运多肽2B1（organic anion transporting polypeptides 2B1，OATP2B1）过表达的人胚胎肾细胞HEK293-OATP2B1及空白转染的人胚胎肾细胞HEK293-mock]，应用实时定量荧光PCR、LC-MS/MS联用、放射性同位素示踪等技术，共同研究淫羊藿苷元在肠道的跨膜转运机制。Caco-2细胞研究中，ICT在低浓度给药时摄入方向表观渗透系数（app）较小，渗透性较弱，存在明显外排，且外排可被BCRP抑制剂明显抑制，不能被P-糖蛋白（P-glycolprotein，P-gp）抑制剂明显抑制，随着给药浓度的增加，外排逐渐减弱，摄入方向app逐渐增加，渗透性逐渐增强。通过人药物转运蛋白细胞系研究，ICT可显著抑制BCRP和OATP2B1的转运，对BCRP和OATP2B1转运蛋白的半数抑制浓度（IC50）分别为6.33、31.8 μmol/L；同时，ICT是BCRP和OATP2B1的底物。通过LS-180细胞诱导研究表明，ICT不能诱导肠道外排蛋白P-gp、BCRP的表达上调。ICT在肠内通过被动扩散和主动转运2种机制吸收，其中被动扩散能力弱，主动转运包括外排转运蛋白BCRP的外排和摄入转运蛋白OATP2B1摄入共同介导，且对肠道外排转运蛋白无诱导表达功能。BCRP的外排对ICT吸收影响有限，这可能与ICT的给药浓度及BCRP的饱和浓度有关。

淫羊藿苷元；肠道吸收；转运机制；Caco-2细胞；LS-180细胞；P-糖蛋白；乳腺癌耐药蛋白；多药耐药相关蛋白2；有机阴离子转运多肽2B1

淫羊藿苷元（icaritin，ICT）是从小檗科淫羊藿属植物淫羊藿中提取的一种多羟基黄酮类化合物，为淫羊藿苷水解物。ICT是一种毒性较低且高效的癌症治疗剂[1]，对急性髓系白血病、恶性淋巴瘤、肝癌、肺癌、乳腺癌等具有明显的抗肿瘤作用[2-7]。但ICT的溶解性差，口服生物利用度低，且对其肠道吸收机制尚无全面报道。

药物吸收转运的方式主要包括细胞间转运（paracellular transport）和跨膜转运（transcellular transport）；跨膜转运又可分为被动扩散和转运体介导的跨膜转运（transporter mediated transport）。药物的转运可能采取单一转运机制吸收，也可兼有几种转运方式。大多数药物通常首先采取被动扩散，其次采取转运蛋白介导的跨膜转运。肠道细胞膜上的转运蛋白在肠道吸收中起着重要甚至决定性的作用[8-9]。在人体肠道中表达的药物转运蛋白主要包括外排转运蛋白 [如P-糖蛋白（P-glycolprotein，P-gp，又名MDR1）、乳腺癌耐药蛋白（breast cancer resistance protein，BCRP）和多药耐药相关蛋白2（multidrug resistance-associated protein 2，MRP2）] 和摄取转运蛋白2B1 [如有机阴离子转运多肽（organic anion transporting polypeptides 2B1，OATP2B1）和寡肽转运蛋白1（peptide transporter 1，PEPT1）][10]。ICT是一种多羟基黄酮类化合物，不具有PEPT1的底物结构特性（含有肽样结构）。因此，本研究仅探讨ICT与P-gp、BCRP、MRP2和OATP2B1之间的关系。

本研究采用体外细胞模型结肠癌Caco-2细胞和人转运蛋白转染细胞系（MDR1、BCRP、MRP2过表达的狗肾细胞系MDCK-MDR1、MDCK-BCRP、MDCK-MRP2和OATP2B1过表达的人胚胎肾细胞HEK293-OATP2B1及空白转染的人胚胎肾细胞HEK293-mock），共同研究ICT的吸收机制。此外，还使用小肠癌LS-180细胞系研究ICT对外排转运蛋白的诱导，以确认是否存在由外排转运蛋白的表达上调引起的生物利用度降低机制。

1 材料

1.1 药品与试剂

ICT（中国食品药品检定研究院，质量分数99.7%，批号16052601），内标乙氧苯柳胺（中国食品药品检定研究院，质量分数98.6%，批号100680-200901）；3H-普萘洛尔、3H-地高辛、3H-硫酸雌酮（estrone sulfate，ES）、3H-雌二醇葡糖苷酸（estradiol glucuronide，EG）（美国ARC公司，批号分别为160721、160624、140331、141231）；14C-PEG4000（Perkin Elmer公司，批号2195563），维拉帕米、BCRP抑制剂Ko143、利福平、波生坦、沙奎那韦、环孢素A（美国MCE公司，批号分别为18578、03621、11246、15327、160708、11724）；DMEM高糖培养基、青链霉素混合液（100×）、Phosphate Buffered Saline（PBS，1×）、HBSS（含钙镁）、含EDTA的0.25%胰酶、胎牛血清（美国Gibco公司）；Transwell 12孔聚碳酸酯膜转运板、胶原蛋白包被板（美国Coning公司）。

1.2 仪器

Olympus-CKX41倒置显微镜，日本Olympus公司；二氧化碳培养箱，美国Thermo公司；Millcell ERS-2跨上皮电阻仪，美国Millipore公司；Tri-Carb 2910 TR放射性液体闪烁仪，PerKinElmer公司；ZHWY-上海智诚恒温振荡器，北京华威兴业科技有限公司；Sorvall Legend Micro 17R台式高速冷冻离心机，美国Thermo公司；Agilent1100 HPLC-UV系统，日本安捷伦公司；LCMS-8060超快速三重四极杆液质联用仪，配有LC-30AD二元输送泵、SIL-30AC自动进样器、DGU-20A5R真空脱气机和CTO-20A柱温箱，日本Shimadzu公司；Mastercycler ep Realplex2实时荧光定量PCR（qRT-PCR）仪，德国Eppendorf公司。

1.3 细胞株

Caco-2细胞及LS-180细胞购自国家实验细胞资源共享平台。药物转运蛋白细胞株MDCK-MDR1、MDCK-BCRP、MDCK-mock、HEK293-OATP2B1和HEK293-mock由日本富士生物医药研究所赠予；MDCK-MRP2细胞由大连医科大学刘克辛教授团队赠予。

2 方法

2.1 细胞培养

所有细胞系均于培养皿内，以DMEM为培养基（含10% FBS、1%青链霉素），在37 ℃、5% CO2和相对湿度90%的培养箱内培养，当细胞覆盖盘底80%～90%时，用含0.25% EDTA的胰酶消化。本实验所用的Caco-2细胞为32～35代，LS-180细胞为22～25代，MDCK-MDR1细胞为29～30代、MDCK-BCRP细胞为19～20代、MDCK-MRP2细胞为22～24代，HEK293-mock细胞为24～25代，HEK293-OATP2B1细胞为26～28代。

2.2 MTT测定

将细胞接种于96孔板上，在无药物培养基中培养24 h。Caco-2、LS-180、MDCK、HEK293细胞接种密度分别为5×104/mL、5×104/mL、2.5×104/mL、8×104/mL。之后，加入一系列的ICT，终浓度分别为0.1、0.3、1、3、10、30 μmol/L，与细胞再孵育48 h。随后每孔加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL，孵育20～30 min。最后，在酶标仪上测量反应液在490 nm波长处的吸光度。每个浓度6次重复。使用GraphPad Prism计算半数抑制浓度（IC50）。

2.3 LC-MS/MS分析

2.3.1 色谱条件 色谱柱为InertSustain Bio C18HP（50 mm×2.1 mm，3 μm），柱温40℃，流动相为甲醇-10%甲醇水溶液（含有0.09%甲酸）（7∶3），等度洗脱，体积流量为0.3 mL/min，进样温度6℃。

2.3.2 质谱条件 ESI正离子源，喷雾气体积流量3 L/min，加热气体积流量10 L/min，干燥气体积流量10 L/min，源温300℃，去溶剂气温度250 ℃，加热模块温度400℃；多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）扫描方式：淫羊藿苷元[M＋H]+/369.1→/313.1，碰撞能−30 eV；内标乙氧苯柳胺[M＋H]+/258.1→/121.1，碰撞能−22 eV。

2.4 样品制备及处理

精密称取ICT对照品适量，用甲醇溶液超声溶解配制质量浓度为1 mg/mL的储备液，精密吸取储备液适量，用甲醇稀释配制成含1 μg/mL的ICT甲醇溶液A，用甲醇梯度稀释得质量浓度分别为0.5、1、5、25、100、500、1000 ng/mL的标准曲线溶液；同时，用甲醇稀释配制成含1 μg/mL ICT的甲醇溶液B，用甲醇梯度稀释得质量浓度分别为1、25、800 ng/mL的质控溶液。取各样品溶液50 µL，加入IS 100 μL（乙氧苯柳胺10 ng/mL甲醇溶液），再加入50 µL水，涡旋混匀，取100 µL溶液于内插管中，4 ℃ 12 000 r/min离心10 min，上清液进样2 μL，进行LC-MS/MS定量分析。

2.5 方法学验证

细胞样品中ICT的LC-MS/MS定量分析方法经过了完整的方法学验证，在该分析方法下，细胞中的其余物质不会干扰待测物和内标的测定，ICT的线性范围分别为0.5～1000 ng/mL，曲线斜率的RSD均小于0.205%，相关系数大于0.999，表明在该范围浓度内线性良好。定量下限为0.5 ng/mL，准确度在90.0%～107%，精密度小于5.52%。低、高2个质量浓度水平的基质效应在91%～106%，RSD小于10.5%。

2.6 Caco-2细胞吸收转运研究

用新鲜培养基调细胞密度至2×105/mL，接种于Transwell聚碳酸酯膜12孔板中。在Caco-2细胞层顶端（AP）每孔加0.5 mL细胞悬液，基底端（BL）每孔加1.5 mL新鲜培养基，连续培养21 d，得到完全分化的细胞单层。

用3种已知特性的工具药[3H-普萘洛尔（高渗）、14C-聚乙二醇4000（零渗）和3H-地高辛（外排基质）] 验证Caco-2细胞单层的完整性和功能性。此外，通过使用Millicell-ERS电阻仪测量跨单层的跨上皮电阻（trans epithellal electric resistance，TEER）来评估单层的完整性。实验中仅使用TEER值高于350 Ω/cm2的细胞单层。

样品处理：取细胞液50 µL，加入内标乙氧苯柳胺10 ng/mL甲醇溶液100 μL，再加入50 µL甲醇溶液，涡旋混匀，取100 µL溶液于内插管中，4 ℃、12 000 r/min离心10 min，上清液进样2 μL，进行LC-MS/MS定量分析。

2.6.1 ICT在Caco-2细胞中摄入方向的转运 吸去Transwell小室AP和BL端的培养基，加入37 ℃预热的HBSS溶液，37 ℃平衡20 min；吸去HBSS，在AP端加入0.5 mL预热的含有不同浓度（1、5、25 μmol/L）ICT的HBSS溶液，BL端加入1.5 mL空白HBSS溶液；37 ℃恒温振荡器孵育，在30 min吸取BL端的转运液，LC-MS/MS测定转运液中的ICT浓度。按以下公式计算表观渗透系数（apparent permeation coefficient，app）和外排率（efflux ratio，E）。

app＝×(d/d)×1/×1/0

表示接收室的溶液体积（AP端为0.5 cm3、BL端为1.5 cm3），表示膜的面积（1.13 cm2），0表示药物的起始浓度，d/d表示接收室在单位时间获得的药物浓度，即接收室的最终浓度除以转运时间

E＝app(B-A)/app(A-B)

A-B代表AP→BL，B-A代表BL→AP，当所测药物的E≥2时，表示药物可能为肠道外排转运蛋白的底物，当所测药物的E≤0.5时，表示该药物可能为肠道摄入转运蛋白的底物

2.6.2 ICT在Caco-2细胞中外排方向的转运 吸去Transwell小室AP和BL端的培养基，加入37 ℃预热的HBSS溶液，37 ℃平衡20 min；吸去HBSS，在AP端加入0.5 mL空白HBSS溶液，BL端加入预热的含有不同浓度（1、5、25 μmol/L）ICT的HBSS溶液；37 ℃恒温振荡器孵育一段时间；吸取AP端的转运液，LC-MS/MS测定转运液中的ICT浓度。计算app和E。

2.6.3 P-gp抑制剂维拉帕米及BCRP抑制剂Ko143对ICT在Caco-2细胞转运的影响 用同时含有50 μmol/L维拉帕米或0.5 μmol/LKo143和ICT的给药液代替只含ICT的给药液即可，其他操作相同。计算app和E。

2.7 ICT对人体肠道中表达的药物转运蛋白的抑制研究

2.7.1 摄入转运蛋白 用新鲜DMEM培养基调细胞密度至1.5×105/mL，接种于24孔板中，连续培养2～3 d后，用于抑制实验。去除培养板内DMEM，将HEK293-OATP2B1和HEK293-mock细胞置于DPBS缓冲液中37 ℃平衡10 min。将含放射性标记的探针底物3H-ES（0.05 μmol/L）的阳性抑制剂利福平或不同浓度（0、0.3、1、3、10、30 μmol/L）ICT的给药混合溶液置换DPBS，每个浓度设置3个复孔，在各细胞中反应2 min。另设对照组，给药液换成只含放射性底物不含抑制剂的溶液。用冷DPBS洗涤3次将抑制实验终止。然后，将细胞溶解在0.1 mol/L的NaOH溶液中，提取后在每个样品中加入3.5 mL闪烁液，混匀，用液体闪烁分析仪进行定量测定。计算抑制率，以表征ICT对转运体的抑制作用的强弱。

抑制率＝(－0)/(c－0)

c表示对照组的DPM（每分钟衰变数）值，0表示mock细胞的DPM值，表示各给药组的DPM值

2.7.2 外排转运蛋白 用培养基调整细胞密度至1×105/mL，接种于Transwell 12孔板中。连续培养7 d，得到完全分化的细胞单层。实验中仅使用TEER值高于150 Ω/cm2的细胞单层。去除培养板内DMEM，将MDCK-MDR1、MDCK-BCRP、MDCK-MRP2和MDCK-mock细胞置于DPBS缓冲液中37 ℃平衡10 min。MDR1、BCRP及MRP2转运蛋白使用的底物分别为3H-地高辛（1 μCi/mL）、3H-ES（1 μCi/mL）及3H-EG（1 μCi/mL）；抑制剂分别为维拉帕米（100 μmol/L）、Ko143（1 μmol/L）及环孢素A（30 μmol/L）。将含放射性标记探针底物的阳性抑制剂或不同浓度ICT（0、0.3、1、3、10、30 μmol/L）的给药混合溶液置换DPBS，每个浓度设置3个复孔，在各细胞中反应15 min。另设对照组，给药液换成只含放射性底物不含抑制剂的溶液。取100 μL转运液，分别加入3.5 mL闪烁液，混匀，用液体闪烁分析仪进行定量测定。计算抑制率。

2.8 底物研究

2.8.1 摄入转运蛋白 考察摄入转运蛋白细胞对ICT的吸收转运的影响。实验操作同“2.7.1”项，将不同浓度（1、10、100 μmol/L）ICT的给药混合溶液置换DPBS，每个浓度设置3复孔，在HEK293-OATP2B1和HEK293-mock细胞中反应2 min。用冷DPBS洗涤3次将抑制实验终止，然后吸去DPBS后向24孔板的每孔中加入300 μL甲醇。样品处理同“2.4”项。

2.8.2 外排转运蛋白 分别用MDCK-MDR1、MDCK-BCRP细胞研究不同浓度（1、5、25 μmol/L）ICT的吸收转运情况，实验操作同“2.6”项。

2.9 LS-180细胞诱导研究

LS-180细胞以每孔1.5×105/mL的密度接种于12孔板中，在不含药物的培养基中培养24 h。然后，用含ICT（1、10、30 μmol/L）的培养基与LS-180细胞72 h共培养，以添加P-gp、BCRP和MRP2诱导剂利福平（10 μmol/L）、波生坦（10 μmol/L）[11]和沙奎那韦（10 μmol/L）[12]的细胞分别作为阳性对照组，而在未添加药物的培养基中生长的细胞作为对照组。然后用TRIzol总RNA提取试剂盒收集细胞，提取RNA，并逆转录为cDNA，用qRT-PCR进行扩增检测。

以逆转录的cDNA为模板，qRT-PCR反应体系为Fast Start Universal SYBR Green Master（Rox）12.5 μL，上游引物（10 μmol/L）0.75 μL，下游引物（10 μmol/L）0.75 μL，水（PCR-grade）9 μL，cDNA 模板2 μL，总体积25 μL。反应条件为95 ℃预变性10 min，95 ℃变性15 s，60 ℃退火1 min，40个循环，60～95 ℃进行熔解曲线分析。引物序列见表1。

2.10 数据处理

3 结果

3.1 MTT检测

结果显示，ICT对Caco-2细胞的IC50超过30 μmol/L，表明ICT在0.1～30 μmol/L浓度范围内对细胞无损伤；同样，ICT在相同浓度范围内对LS-180、MDCK和HEK293细胞未表现出毒性。

表1 qRT-PCR引物序列

Table 1 Sequences of primers used for qRT-PCR analysis

引物序列 (5’-3’)来源 β-actin-FGGCATCCTCACCCTGAAGTABGI β-actin-RGGGGTGTTGAAGGTCTCAAABGI ABCB1-FCCCATCATTGCAATAGCAGGBGI ABCB1-RTGTTCAAACTTCTGCTCCTGABGI ABCG2-FAGATGGGTTTCCAAGCGTTCATBGI ABCG2-RCCAGTCCCAGTACGACTGTGACABGI ABCC2-FACAGAGGCTGGTGGCAACCBGI ABCC2-RACCATTACCTTGTCACTGTCCATGABGI

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3.2 Caco-2细胞吸收转运研究

Caco-2细胞模型中ICT双向转运的app和E值如表2所示。ICT摄取的app值逐渐升高，ICT有明显的外排现象，且随着浓度的升高，外排现象逐渐消失。当ICT浓度为1 μmol/L时，Ko143可显著抑制ICT的外排，当ICT浓度为25 μmol/L时，E小于0.5，表明ICT在肠道通过被动扩散及主动转运共同吸收入血，其中主动转运可能同时包括外排和摄入2种形式。

3.3 ICT对药物转运蛋白的抑制研究

结果见图2、3。ICT（0.3～30 μmol/L）对MRP2介导的3H-EG转运活性无明显抑制作用。在3～30 μmol/L浓度时，ICT对P-gp介导的3H-地高辛转运活性具有显着抑制作用（＜0.05、0.01），但IC50＞30 μmol/L。在1～30 μmol/L浓度时，ICT可显著抑制BCRP介导的3H-ES的转运（＜0.05、0.01），IC50为6.63 μmol/L。当ICT浓度为10、30 μmol/L时，OATP2B1介导的3H-EG转运活性受到显着抑制（＜0.05、0.01），IC50约为30 μmol/L。

表2 淫羊藿苷元在Caco-2细胞中双向转运的Papp值和RE值()

Table 2 Papp and RE of ICT bi-directional transport in Caco-2 cell ()

组别浓度/(μmol·L−1)Papp/(×10−6 cm·s−1)REAP→BLBL→AP ICT10.175±0.0210.730±0.0464.16 50.547±0.0740.639±0.0331.17 250.874±0.0430.410±0.0080.47 ICT＋维拉帕米1＋500.177±0.0190.576±0.0283.26 5＋500.613±0.0960.755±0.0621.23 25＋501.040±0.1170.475±0.0380.46 ICT＋Ko1431＋0.50.212±0.0200.419±0.0161.98 5＋0.50.598±0.0820.613±0.0531.03 25＋0.51.160±0.0960.428±0.0300.38

Ver-维拉帕米 CsA-环孢素A Rif-利福平 与对照组比较：*P＜0.05 **P＜0.01

图3 淫羊藿苷元对BCRP和OATP2B1的转运抑制作用的IC50()

3.4 底物研究

3.4.1 外排转运蛋白 MDCK-MDR1/BCRP细胞中ICT双向转运的app和E值见表3。MDCK-BCRP中有明显的ICT外排，随着ICT浓度的增加而逐渐减少，且Ko143能显著抑制ICT的外排。MDCK-MDR1中没有显著的ICT外排，加入维拉帕米后也没有显著变化。结果表明ICT是BCRP的转运底物。

3.4.2 摄取转运蛋白 HEK293-OATP2B1和HEK293-mock细胞中的ICT转运的结果如图4所示。当ICT浓度为30 μmol/L时，OATP2B1介导的ICT摄取是mock细胞的2.67倍，ES可显著抑制HEK293-OATP2B1细胞对ICT的摄取。结果表明ICT是OATP2B1的底物。

3.5 LS-180细胞诱导研究

阳性对照利福平、波生坦、沙奎那韦均可分别显著上调（）、（）和（）的mRNA表达水平，但ICT不上调、和的mRNA表达水平，即不诱导、或表达（图5）。

表3 淫羊藿苷元在MDCK-MDR1细胞及MDCK-BCRP细胞中双向转运的Papp值和RE值()

Table 3 Papp and RE of ICT bi-directional transport in MDCK-MDR1 and MDCK-BCRP cells ()

组别浓度/(μmol·L−1)细胞Papp/(×10−6 cm·s−1)REAP→BLBL→AP ICT1MDCK-MDR10.415±0.0220.522±0.0411.260 50.547±0.0620.539±0.0320.985 250.574±0.0430.510±0.0420.889 ICT＋维拉帕米1＋500.437±0.0160.506±0.0321.160 5＋500.513±0.0910.475±0.0690.926 25＋500.484±0.0320.478±0.0370.988 ICT1MDCK-BCRP0.156±0.0330.925±0.1255.930 50.352±0.0630.806±0.0472.290 250.433±0.0540.450±0.0671.040 ICT＋Ko1431＋0.50.205±0.0120.517±0.0282.520 5＋0.50.347±0.0770.718±0.0502.070 25＋0.50.571±0.0760.477±0.0360.835

与HEK293-mock细胞比较：*P＜0.05 **P＜0.01

4 讨论

目前研究药物肠道跨膜转运机制的方法主要有体内法、在体法和体外法3种，体内法能够真实反映药物的总体吸收情况，但难以从细胞和分子水平探讨药物的跨膜转运机制；在体法保证了肠道神经和血管的完整性，常用于研究药物的渗透和吸收动力学，但该方法技术难度大，干扰因素较多[13-14]；体外法简便易行，实验条件容易控制，主要用于研究药物的肠道跨膜转运机制[15-16]。

与对照组比较：*P＜0.05 **P＜0.01

Caco-2细胞在形态和功能上与肠上皮细胞相似，可以表达多种刷状缘酶、一些细胞色素P450（cytochrome P450，CYP450）酶和一些内源性活性转运蛋白和药物转运蛋白[17-18]。因为Caco-2细胞含有多种转运蛋白[19]，不利于研究单个转运蛋白对药物的影响。人转运蛋白转染细胞系是特异性过度表达人类转运蛋白基因并被目标转运蛋白稳定转染的细胞系。Caco-2与转运蛋白转染细胞的联合使用，可更直观、更准确地分析转运蛋白在药物吸收中的作用与贡献度。但Caco-2因为缺乏典型的人孕烷受体（pregnane X receptor，PXR）和类固醇外源异物受体（steroid and xenobiotic receptor，SXR），因此其不是评价转运蛋白诱导的好模型。SXR的配体如利福平可增加小肠癌LS-180细胞上P-gp和CYP3A4的表达，因此，业内一般用LS-180细胞系来评价P-gp等的诱导[20-21]。

本研究结果表明，ICT可显著抑制P-gp、BCRP和OATP2B1的转运活性，且ICT也是BCRP和OATP2B1的转运底物。因此，ICT在肠道可通过被动扩散和主动转运吸收入血。其中，主动转运包括BCRP介导的外排和OATP2B1介导的摄取。当ICT在低浓度时外排明显，在高浓度时外排出现饱和，且同时出现OATP2B1介导的摄入。但是，ICT不诱导LS-180细胞中P-gp、BCRP和MRP2的表达，推测不会通过诱导BCRP的表达来降低ICT的生物利用度。随着药物浓度的增加，ICT的吸收增强，但结果显示ICT是低渗透性化合物，这可能是导致其生物利用度低的主要原因。本研究首次系统深入地研究了淫羊藿苷在肠道内的吸收机制和可能的转运蛋白介导的药物相互作用，为临床开发和应用提供可靠的支撑。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

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Study on transmembrane transport mechanism of icariin in intestine

CI Xiao-yan1, 2, 3, SUN Ying-hui1, 2, WU Wei-dang1, 2, ZENG Yong1, 2, LIU Chang-xiao1, 2, YI Xiu-lin1, 2, YAN Feng-ying1, 2, 3

1.State Key Laboratory of Drug Delivery Technology and Pharmacokinetics, Tianjin Institute of Pharmaceutical Research, Tianjin 300462, China 2.Research Unit for Drug Metabolism, Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing 100730, China 3.Tianjin Hechuang Biotechnology Co., Ltd., Tianjin 300301, China

To explore the transport mechanism of icaritin (ICT) in the intestine and clarify the main reasons for the low bioavailability of ICT.cell models including Caco-2 and LS-180 cells and human drug transporter-transfected cell models includingP-glycolprotein (P-gp, also known as MDR1), breast cancer resistance protein (BCRP), multidrug resistance-associated protein 2 (MRP2) overexpressed in canine kidney cell lines MDCK-MDR1, MDCK-BCRP, MDCK-MRP2, and blank transfected canine kidney cell line MDCK-mock; organic anion transporting polypeptides 2B1 (OATP2B1) overexpressed human embryonic kidney cells HEK293-OATP2B1 and blank transfected human embryonic kidney cells HEK293-mock were used.Real-time quantitative fluorescence PCR, LC-MS/MS, radioisotope tracer and other techniques were used to study the transmembrane transport mechanism of ICT in intestinal tract.In the study of Caco-2 cell, the apparent permeability coefficient (app) of ICT in the direction of intake was small and the permeability was weak at low concentrations, and its efflux could be significantly inhibited by BCRP inhibitors, but not by P-gp inhibitors.With the increase of the concentration of administration, the efflux gradually weakened, the intake direction ofappgradually increased, and the permeability gradually increased.Through the study of the human drug transporter cell line, ICT could significantly inhibit the transport of BCRP and OATP2B1, with IC50values of 6.33 and 31.8 μmol/L, respectively.ICT was the substrate of BCRP and OATP2B1.LS-180 cell induction study showed that ICT could not induce up-regulation of the expression of intestinal efflux protein P-gp and BCRP.ICT is absorbed in intestine through passive diffusion and active transport, of which passive diffusion capacity is weak.The active transport is mediated by efflux of BCRP and uptake of uptake transporter OATP2B1, and has no induction expression function for intestinal efflux transporter.The efflux of BCRP has a limited effect on ICT absorption, which may be related to the dose concentration of ICT and the saturation concentration of BCRP.

icaritin; intestinal absorption; transport mechanism; Caco-2 cells; LS-180 cells; P-glycolprotein; breast cancer resistance protein; multidrug resistance-associated protein 2; organic anion transporting polypeptides 2B1

R285

A

0253 - 2670(2022)09- 2747 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.09.018

2021-10-12

中国医学科学院医学与健康科技创新工程项目（2019-I2M-5-020）

慈小燕（1987—），副研究员，主要从事药动学及细胞质控研究。Tel: 13622099172 E-mail: cixy@tjipr.com.cn

通信作者：伊秀林（1964—），研究员，主要从事药动学研究工作。E-mail: yixl@tjipr.com.cn

闫凤英（1963—），高级工程师，主要从事生物技术药物研究与产业化工作。E-mail: yanfy@tjipr.com

[责任编辑 潘明佳]