基于马铃薯叶片光纤光谱信息的晚疫病患病程度预测

侯冰茹， 刘鹏辉， 张 洋， 胡耀华， 2， 3*

1. 西北农林科技大学机械与电子工程学院， 陕西 杨凌 712100

2. 陕西省农业信息感知与智能服务重点实验室， 陕西 杨凌 712100

3. 浙江农林大学光机电工程学院， 浙江 杭州 311300

引 言

马铃薯是粮菜兼用型作物， 也是仅次于小麦、 水稻、 玉米的世界第四大粮食作物。 在我国马铃薯主要种植区， 由致病疫霉侵染引起的晚疫病是马铃薯产量的毁灭性病害， 也是所有引起产量损失的病害中最严重的一种卵菌性病害[1]。 该病在马铃薯整个生育期均可发生， 严重时可导致马铃薯绝收。 因此研究马铃薯晚疫病害的发生及流行时期预测对马铃薯晚疫病害的防治具有重要意义。

近年来光谱技术由于其分析迅速、 不破坏样品、 不消耗化学试剂、 不污染环境等优点被广泛应用于农作物病虫害无损检测领域中。 光谱技术结合图像处理、 化学计量学方法和与病害有关的一些理化参数可实现对农作物病害的早期检测， 并达到了很好的效果。 其中结合化学计量学方法可实现对农作物病害的发病程度的定性分类判别， 如程术希等[2]采用偏最小二乘回归(partial least square regression， PLSR)算法对不同水稻稻叶瘟染病程度的叶片进行化学计量学分析， 建立了稻叶瘟染病程度检测模型， 利用光谱技术可实现病害胁迫下农作物叶片的各种酶活性等理化值的预测， 如程帆[3]等实现了细菌性角斑病早期胁迫下黄瓜叶片中过氧化物酶活性的测定， 杨燕等[4]通过建立基于光谱信息的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase， SOD)预测模型反演出水稻稻瘟病潜育期内的SOD酶活性， 胡耀华等[5]利用高光谱技术建立了基于X-LW-PLS的定量模型用以预测马铃薯晚疫病叶片中过氧化物酶的活性。 这些研究侧重于不同程度病害胁迫下作物各种理化值的预测和变化规律的研究， 未能将理化值的变化规律同病害发病机理结合以实现染病程度的定性预测。

过氧化物酶(peroxidase， POD)是一种用于评价植物抗逆性的酶， 其在植物染病期间是不断变化的， 并与植物患病程度直接相关。 Li[6]等建立了晚疫病胁迫下不同种类马铃薯叶片POD酶活性相对于患病时间的五阶模型， 证明了利用POD酶活性反演晚疫病害程度的可行性。 因此先利用叶片的光谱信息实现对POD酶活性的定量预测， 再利用预测的POD酶活性进而实现对马铃薯晚疫病害的定性预测是可行的。

本研究以不同患病程度的马铃薯叶片为研究对象， 利用光谱对不同温湿度条件下的马铃薯叶片的POD酶活性进行快速测定， 研究POD酶活性随患病程度变化的规律， 实现基于POD酶活性的马铃薯晚疫病患病程度的定性预测， 对野外马铃薯晚疫病害的早期检测和防治及便携式检测仪的研制提供科学依据。

1 实验部分

1.1 试验材料

选用“陇薯1号”种薯， 其属晚疫病中感品种， 广泛种植于西北地区。 于2020年1月种植于杨凌现代示范农业园区温室大棚内， 以盆栽方式培养。 在马铃薯生长后期(开花末期)采集若干片健康状况良好、 大小一致的马铃薯叶片接种致病疫霉， 图1为接菌后的马铃薯叶片， 接种后用保鲜膜将放置叶片容器密封保湿， 置于温度为(17±1) ℃的人工气候培养箱(RGX-250B， 上海坤天实验室仪器有限公司， 中国)中培养24 h以确保侵染成功。 由于马铃薯晚疫病害流行的最适宜温度为16～24 ℃、 适宜的发病湿度为85%以上， 为模拟不同马铃薯晚疫病害发生的环境条件， 因此分别设置15， 20和25 ℃的温度梯度及70%， 80%和90%的湿度梯度。 将叶片随机分为9组， 每组15片， 将9组叶片分别放入不同温湿度条件的培养箱中进行为期5天的离体培养， 图2为在温度为20 ℃、 湿度为70%的环境条件下经1～5 d培养后的马铃薯叶片图像。

图1 接菌后的离体马铃薯叶片

图2 温度为20 ℃、 湿度为70%环境条件下培养的第1～5天的叶片图像

1.2 光谱采集

为避免样品温度对光谱反射率的影响， 在同一室温条件下对叶片进行光谱采集。 采用如图3所示的波长范围为350～1 000 nm的可见光/近红外光纤光谱仪(USB4000， Ocean Optics， Dunedin， Florida， USA)并结合便携式反射探头(PRB-D0-IS30， 江阴韵翔光电技术有限公司， 中国)对马铃薯叶片光谱采集。 选择病斑部位作为感兴趣区域， 使用探头垂直照射叶片病斑部位表面， 将三次重复测量的感兴趣区域部位的光谱反射率的平均值作为样本的光谱反射率。

图3 光谱采集系统

1.3 POD酶活性测定

剪取叶片的感兴趣区域部位， 对其利用分光光度法实现POD酶活性的测定， 采用酶标仪(YMB-7A， 厦门亿恩达仪器设备有限公司， 中国)进行吸光值的测定， 每隔1 min记录其在470 nm处的吸光值， 共记录3次， 以每分钟吸光值变化0.01定义为一个酶活性单位， 计算POD酶活性[7]。

1.4 化学计量学建模方法

图4 异常样本检测结果

表1 马铃薯叶片POD酶活性统计结果

1.5 数据处理软件

利用SpectraSuite(Ocean Optics， USA)软件实现对光谱的采集； 利用The Unscrambler X(CAMO， Norway)软件进行光谱数据的预处理； 利用MATLAB(MathWorks， USA)软件实现了数据划分、 异常样本检测、 PLS模型建立、 评估及特征波长的提取。

2 结果与讨论

2.1 马铃薯叶片光谱曲线及POD酶活性变化规律分析

光谱仪的波长测量范围为350～1 000 nm， 由于受环境和仪器噪声的影响， 350～480和950～1 000 nm波段范围内反射率变化波动较大， 因此选择480～950 nm波段的光谱数据进行分析。 图5为不同接菌时间的马铃薯叶片光谱曲线。 550 nm处的反射率与叶绿素含量有关， 近红外波段的反射率与细胞结构有关， 随着接菌时间的增加， 叶片内叶绿素含量降低， 叶片细胞壁被破坏、 细胞空隙变大， 导致550 nm处和近红外波段的光谱反射率随接菌时间的增加而减小。 并且随着接菌时间的增加， 760 nm波长附近由于水或氧的窄吸收带导致的微弱波谷[9]发生了左移。

图5 不同接菌时间时的马铃薯叶片光谱曲线

通过分析图2中接菌后第1～5 d的马铃薯叶片图像可知， 接菌1 d时叶片无明显变化， 2 d时叶片出现褐色斑点， 随着接菌时间的增加， 褐色斑点迅速向外扩大， 在4 d时病斑产生白霉， 此后病斑扩大速率降低， 其与马铃薯叶片染病的基本症状基本一致， 在本研究的实验条件下认为接菌后0～1 d为染病初期、 1～4 d为染病中期、 4～5 d为染病后期。 图6和图7分别为不同温度、 湿度条件下POD酶活性随接菌时间的变化， 从图中可看出不同温湿度环境条件下POD酶活性随接菌时间变化的趋势较明显， 其大致呈先降后升再降的趋势， 且POD酶活性均在第1天达到最小值、 在第4天达到最大值。 这与植物体内防御系统有关， 染病初期POD酶活性下降是由于病菌扰乱了植株体内的代谢平衡， 之后酶活性升高是由于当处于染病中期时植物体内产生大量的POD酶来清除病菌造成的活性氧伤沪， 随着染病程度的不断增加， 植物防御失败导致植物叶片细胞壁被破坏， 酶活性也随之降低[10]。

图6 同一湿度不同温度条件下POD酶活性随接菌时间的变化情况

但温湿度同样对POD酶活性变化产生影响， 从图6可看出控制湿度条件相同、 温度条件不同时， 不同温度条件下POD酶活性变化速率并不一致， 当叶片分别处于染病初期、 中期及后期时， 对应20， 25和15 ℃条件下POD酶活性变化相对剧烈。 从图7可看出控制温度条件相同、 湿度条件不同时， 当叶片分别处于染病初期、 中期及后期时， 对应90%， 70%和80%湿度条件下POD酶活性变化相对剧烈。 这说明马铃薯晚疫病害在不同染病阶段的较适宜的患病流行条件也不相同， 但温湿度对POD酶活性变化影响的强弱还需进一步建模讨论。

图7 同一温度不同湿度条件下POD酶活性随接菌时间的变化情况

通过上述分析可知， 光谱反射率和POD酶活性都会以一定规律随患病程度变化 ， 说明POD酶活性与光谱反射率具有一定的相关关系， 通过采集叶片的光谱信息可实现对POD酶活性的定量检测。

2.2 POD酶活性预测模型建立

2.2.1 光谱数据预处理

用光谱仪所获取的数据不仅包括样本的成分信息， 还包括仪器噪声、 杂散光、 背景信息、 基线漂移等无关信息， 因此光谱数据应先进行预处理以建立稳定可靠的数学模型。 采用了中心化(mean centering, MC)、 归一化(normalization)、 S-G卷积平滑(Savitzky-Golay smoothing)、 移动窗口平均平滑(moving average smoothing)、 多元散射校正(multiplicative scatter correction， MSC)、 标准正态变量变换(standard normal variate transformation， SNV)、 基线漂移(baseline)、 导数算法(derivative)等八种预处理方法对光谱数据进行预处理。 表2为不同预处理方法所建立的全波长光谱数据PLS模型效果， 其中参与建模的变量数是通过多次建模测试得出， 具体做法为： 参与PLS建模的变量数从1开始逐渐增加， 利用留一交叉验证建立PLS模型， 当求得的预测集的误差均方根最小时， 以此时的参与PLS建模的变量数为最终参与PLS建模的变量数。 从表2可以看出， 利用二阶导数算法处理后的数据所建立的模型的建模和预测效果远远差于其他模型， 这是由于经二阶求导后的导数光谱与实际相比存在较大误差， 使得参与建模的变量数大大降低， 导致模型效果变差。 经中心化和基线漂移处理后， 模型的效果提升， 比较来看， 经中心化处理后的数据所建立的模型的建模集和预测集的均方根误差相差较小， 模型稳定性相对较好， 因此选择中心化方法对光谱数据进行预处理。

表2 不同预处理方法所建立的全波长光谱数据PLS模型结果

2.2.2 特征波长提取

由于光谱数据波段较多(采集的有效波长为2 457个)， 大量数据不仅增加建模复杂程度， 并且其中包含的大量冗余和共线性数据会影响建模精度[11]， 因此采用了随机青蛙算法(random frog， RF)、 连续投影算法(successive projections algorithm， SPA)、 竞争自适应加权算法(competitive adaptive reweighted sampling， CARS)对特征波长进行提取。

RF算法[12]通过计算每个变量的被选概率来评价变量的重要性， 由于该算法是基于随机抽样提出的， 每次运行结果可能会出现差异， 为减少随机因素的影响， 将RF算法运行100次。 由于利用RF算法无法得出合适的特征波长数， 因此取运行100次后概率平均值大的前16个波长为特征波长。

SPA算法在数据矩阵中应用变量投影操作寻找含有冗余信息最低、 共线性最少的光谱特征变量组[13]。 在使用SPA算法提取特征波长时将变量数范围放大到了30， 即最多可能选择30个特征波长点。 图8为模型的均方根误差随变量数变化的趋势， 图9为利用SPA算法提取的特征波长分布情况， 从图8中可看出随着变量数的增加， 模型的均方根误差呈先降低再升高的趋势， 当变量数为21时模型的均方根误差最小， 因此利用SPA算法提取的最佳特征波长数目为21。

图8 模型均方根误差随变量数变化的趋势

图9 特征波长分布情况

CARS算法能够选择出PLS模型中相关系数较大的波长， 并利用交叉验证逐步选择出均方根误差最小的子集， 该子集里的变量即为被选择的波长变量[14]。 同SPA算法相同， 设置其参与建模的潜在变量数为30， 共运行100次。 图10为CARS算法运行结果， 图10(a)可看出随运行次数增加被选择的变量数在逐步减小， 运行次数和变量数大致呈指数关系， 从图10(b)中可看出当运行次数为40时， 均方根误差达到最小值。 最终利用CARS算法所提取的最佳特征波长数目为72。 各算法提取的特征波长如表3所示， 分析表3可知利用三种算法提取的特征波长在可见光区域和近红外区域均有分布， 且在可见光区域集中在绿光波段(492～577 nm)和红光波段(622～760 nm)， 说明POD酶活性对绿光波段和红光波段较为敏感。

表3 各算法提取的特征波长

图10 CARS算法运行结果

2.2.3 模型对比

建立了基于全波长和各方法提取的特征波长的POD酶活性的预测模型， 各模型结果如表4所示。 由表4可看出， 利用RF和SPA算法所建立的模型的建模效果均变差， 可能是由于参与建模波长数目大大减小而导致的一些有效光谱信息被删除所引起的； 但用SPA和CARS算法所建立的模型的预测效果均和原始模型相当。 三种算法比较来看， 利用CARS算法所建立模型的建模集和测试集的决定系数最大、 均方根误差最小， 其建模效果最好， 因此利用CARS算法来进行特征波长的提取效果最好。

表4 基于特征波长和全波长的PLS模型结果

2.3 基于POD酶活性的患病程度预测

由于POD酶活性受温湿度和患病程度的影响， 利用多元线性回归分析和径向基函数神经网络(radial basis function neural network, RBFNN)建立了POD酶活性的动力学模型， 模型中晚疫病患病程度用数字0～3表示， 数字越大表明其患病程度越严重， 将POD酶活性及温湿度作为输入， 输出为晚疫病患病程度， 且为消除不同量纲的影响， 需对输入参数进行归一化处理。 利用多元线性回归分析建模时， 通过对数据归一化、 散点图分析、 线性回归分析后， 筛选出与POD酶活性有显著关系的自变量， 建立的POD酶活性动力学模型如式(1)

y=-0.777t-1.561h+1.407d+4.896th2-3.396t2h2-3.651h2d+7.75h2d2-5.007h2d3+0.8

(1)

式(1)中，y为POD酶活性， 单位U·(g·min)-1；t为温度， 单位℃；h为湿度， 单位%；d为患病程度， 值取0～3。

利用该模型对30个样本的患病程度预测结果如图11(a)所示， 其中4个健康样本被预测为患病样本， 预测准确率为86.7%。 利用RBFNN网络建模时， 以归一化处理后的120个样本为输入样本， 其中50%为训练样本， 25%为测试样本， 25%为验证样本， 不断修改网络参数以提高模型精度。 模型结果显示同温度相比， 湿度对POD酶活性的影响较大。 以图11(b)所示的混淆矩阵评价模型对30个样本的预测结果， 有3个样本预测的患病程度偏严重， 预测准确率为90.0%， 可能是用于测试的叶片生长状况不一， 部分叶片稍许老化， 老化的叶片POD酶活性较正常叶片高， 使得酶活性预测误差偏高， 降低了模型准确率。

图11 利用多元线性回归分析(a)和RBFNN(b)建立的模型对样本患病程度的预测结果

3 结 论

利用光谱对马铃薯叶片POD酶活性进行预测， 比较了多种光谱数据预处理及特征波长提取方法对预测模型精度的影响， 再结合径向基函数神经网络RBFNN实现了基于POD酶活性的马铃薯晚疫病患病程度的预测。 主要结论如下：

(2) POD酶活性随患病程度变化的规律并非呈单调线性趋势。 随着接菌时间的增加， POD酶活性大致呈先降后升再降的趋势， 说明POD酶活性的变化可以反映马铃薯叶片的患病程度。

(3) 基于马铃薯叶片的光纤光谱信息实现了晚疫病患病程度的定性预测。 利用RBF径向基网络建立了POD酶活性和患病时间、 温湿度的动力学模型， 其中温度对POD酶活性变化的影响最小、 接菌时间对其影响最大， 结合POD酶活性预测模型即可实现对患病程度的预测， 预测准确率为90.0%， 说明基于POD酶活性对马铃薯晚疫病患病程度的定性预测是可行的， 对野外马铃薯晚疫病害的早期检测和防治及便携式检测仪的研制提供了科学参考。