卵黄抗体3种提取方法比较

王玉霞 许方方 李梁梁 李凤华

（山东迅达康兽药有限公司，山东济南 250000）

随着社会经济的迅速发展，禽畜业规模化程度越来越高，抗生素滥用也越来越频繁，导致细菌耐药性及抗生素残留问题突出[1]。因此，如何寻找和使用安全可靠的产品替代抗生素成为当今行业的热点问题。目前，市场上已经出现很多抗生素替代品，如抗体、噬菌体、抗菌肽、有机酸、植物提取物等[2]，其中卵黄抗体在禽畜的预防、治疗和促生长等方面有广泛应用。

抗体对动物的预防、治疗及促生长具有重要作用，其特异性和高效性远高于其他疾病防治手段。卵黄抗体作为一种免疫球蛋白，由2条相同的重链与2条相同轻链通过二硫键连接组成[3]。其有很高的耐酸、耐碱、耐热、抗高压等特性，在pH值为4.0～11.0环境下生物活性均具有较高的稳定性[4]。卵黄抗体作为一种无耐药性、无公害、无残留新型绿色药物，对于养殖业防治疾病具有重要意义。

卵黄抗体具有中和病毒、凝集细菌等功能，可以抵御病毒感染宿主细胞，主要有以下几个方面原因：一是卵黄抗体可以黏附在病毒外壳上，从而抑制病毒的继续繁殖；二是抗体可以引起病毒表面受体破坏，从而影响病毒与受体细胞表面的融合，进而阻止病毒核酸进入细胞复制。此外，卵黄抗体还可以提高巨噬细胞的吞噬能力，增加巨噬细胞数量，以避免抗原扩散，消除局部感染[5]。总之，随着抗生素耐药性的逐渐增强，将会有更多的卵黄抗体产品被研发使用，卵黄抗体具有广阔的发展前景。

随着卵黄抗体研究的不断深入，卵黄抗体作为替抗产品在畜牧业养殖中的应用越来越广泛，是一种比较理想的抗生素替代品。卵黄抗体的优势在于细菌不会对其产生耐药性，无药物残留，不易诱发病毒变异，而且还具有治疗效果迅速、特异性强等特点。在卵黄抗体的大规模生产上，由于管理不规范，一些稀释后的样品未去除脂肪和磷酸便直接用于动物免疫，从而对动物产生毒害作用。因此，卵黄抗体的去脂效果好坏就显得极其重要，好的去脂效果可以更好地发挥卵黄抗体的作用。本研究主要对不同方法提取卵黄抗体进行比较，综合比较其优缺点并找出最优的提取方法，以期为今后大规模生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

SPF鸡、高免蛋由长清某养殖场提供；新城疫、禽流感H9标准抗原均购自哈尔滨维科生物技术有限公司；辛酸、泊洛沙姆等试剂均购自天津市精细化工研究所；96孔板购自比克曼生物科技有限公司。

1.2 试验方法

鸡卵黄主要由蛋白质和脂类组成。由于卵黄中含有大量脂类，而脂类中的磷脂和不饱和脂肪酸等极易变质，导致抗体保存时间缩短，禽畜注射了变质的脂肪很容易造成死亡。因此，提取卵黄抗体关键在于去除卵黄中的脂类，保留水溶性的卵黄抗体。提取方法主要有沉淀法、超滤法、反复冻融法及层析法等。

1.2.1 卵黄液的收集。由于鸡蛋表面附着很多杂菌，为防止产品受到污染，首先将收集的高免蛋用0.1%新洁尔灭浸泡15min，自然晾干后再用75%乙醇擦拭干净，将鸡蛋打碎、蛋清和蛋黄分离，弃蛋清和蛋黄膜，保留蛋黄，分别用下列方法提取卵黄抗体。

1.2.2 泊洛沙姆法提取卵黄抗体。泊洛沙姆经常被用作药品添加剂，无毒副作用，是一种表面活性剂，其作用机理主要是打破卵黄的乳化状态，导致其中的脂类可以相互凝结自发沉淀[6]，沉淀结实易分离，进而减少后续操作。具体方法是将卵黄液与水按1∶6体积比例混合均匀，加入1.5%泊洛沙姆后调节pH值至5.0～5.2，置于4℃冰箱静置过夜，次日将过夜分层的卵黄液弃去沉淀并保留上清液。

1.2.3 水稀释法提取卵黄抗体。水稀释法是将卵黄与水以一定比例混合均匀，让卵黄中水溶性的蛋白溶于水，离心后的上清液即为卵黄抗体。其具体方法是将卵黄液与水按1∶8体积比例混合均匀，调节pH值至5.0～5.2，置于4℃冰箱中静置过夜，次日以转速6 000 r/min离心20min，弃去沉淀取上清液。

1.2.4 辛酸法提取卵黄抗体。将卵黄液与0.07mol/L乙酸钠缓冲液按1∶8比例混合均匀，调节pH值至4.5，加入2.5%辛酸搅拌30min，以6 000 r/min离心20min，弃去沉淀取上清液。

1.2.5 抗体效价检测。

（1）血凝试验。在反应板中每孔加入25μL生理盐水，在第1孔中加入25μL抗原，反复抽打3～5次。从第1孔吸取25μL至第2孔，反复抽打。依次稀释至第11孔，从第11孔吸取25μL弃去。每孔依次加入生理盐水25μL、1%鸡红细胞25μL，室温下静置30min后观察。完全无泪珠水流淌的最高稀释倍数为血凝效价。

（2）血凝抑制试验。首先根据血凝试验结果，计算4个血凝单位抗原，将血凝效价除以4即为4个血凝单位抗原稀释倍数。在反应板中第1～11孔加入25μL生理盐水，第12孔加入50μL生理盐水，第1孔加入25μL样品，混匀之后依次稀释至第10孔，第10孔弃去25μL，在第1～11孔中加入4个单位抗原，室温静置30min后，每孔加入1%鸡红细胞，室温下静置40min观察。以完全抑制4个单位抗原的稀释倍数为该样品的血凝抑制效价。

1.2.6 鸡的安全试验。选取10日龄健康的SPF鸡做安全试验，将鸡分为4组，每组5只。其中3组分别注射上述3种不同提取方法提取液5mL；另外1组设为对照组，注射等量生理盐水。连续观察数日，记录有无异常情况。

2 结果与分析

2.1 卵黄抗体物理性质比较

不同提取方法中，由于加入的试剂不同，提取液的物理性质也不同。通过对提取液的颜色、气味及沉淀的结实程度比较分析不同提取方法的优缺点。由表1可知，采用水稀释法和泊洛沙姆法提取的卵黄抗体均为无色、无味液体，且透明度均较好、较清澈；采用辛酸法提取的卵黄抗体呈现淡黄色，伴有辛酸味，透明度亚于水稀释法。泊洛沙姆法沉淀较结实、易分离、易操作，另外2种方法沉淀疏松不易分离。

表1 3种方法提取卵黄抗体的物理性质

2.2 蛋白浓度检测

卵黄抗体蛋白含量用考马斯亮蓝法进行检测，该方法操作简便、快捷。将不同浓度的试样加入考马斯亮蓝标准样品中，在596 nm波长下检测吸光值，根据不同浓度的吸光值绘制标准曲线，然后根据牛血清标准曲线方程得到不同提取方法卵黄抗体的蛋白浓度含量。检测结果表明，用泊洛沙姆方法提的取蛋白含量最高，为24.12mg/mL；其次是水稀释法，为19.89mg/mL；辛酸法蛋白含量最低，为16.56mg/mL。

2.3 抗体效价检测

新城疫和禽流感是当前禽畜养殖业中主要两大疾病，抗体效价的高低对疾病的预防与治疗具有极其重要的作用，因而提取抗体效价的高低可起到关键性作用。本试验采用血凝试验和血凝抑制试验检测不同提取方法卵黄抗体的新城疫和禽流感H9效价。由表2可知，水稀释法的新城疫及禽流感效价最高，辛酸法效价最低。水稀释法抗体溶液体积最高，为68mL；辛酸法次之，为65mL；泊洛沙姆法最低，为32mL。

表2 3种方法提卵黄抗体效价及溶液体积

2.4 鸡的安全性试验

连续观察5 d，鸡的粪便、饮食及精神状态都无异常，与对照组相同；继续观察至14 d，均无死亡发生，存活率100%。这表明提取的卵黄抗体安全、无毒害。

3 结论与讨论

本试验研究中3种提取卵黄抗体的方法所用试剂均无毒、无污染，辛酸、泊洛沙姆也广泛应用于医药行业，提取方法各有优缺点。本文从物理性质、蛋白含量、抗体效价及安全性等方面展现了3种不同方法的优缺点。其中泊洛沙姆法沉淀结实，上清液易于分离，但是提取液体积较少，不如水稀释法提取液体积多，而且新城疫和禽流感效价不如水稀释法效价高。水稀释法的新城疫和禽流感效价均可达10以上，均高于另外2种卵黄抗体的提取方法，这对防治家禽疾病具有重要作用，而且水提取法操作简单、化学试剂使用较少、蛋白提取率高，比较符合当代社会便捷的提取理念。综合考虑，采用水提法提取卵黄抗体效果比较好、性状稳定，适合车间大规模生产。