骨髓间充质干细胞外泌体介导miR-124-1 对小胶质细胞M2型极化调控的影响

郝 磊，金 戈，杨涌涛，王军伟，孙 洋，秦翠玲，展群岭

重庆市第五人民医院神经内科，重庆 400062

脑卒中，尤其是缺血性脑卒中（ischemic stroke，ⅠS），是患者致残、致死的重要病因之一［1］。炎症伴随着ⅠS的发生即刻开始。小胶质细胞（microglia，MG）快速活化，作为其急先锋（第一感受器）对炎症的发生迅速作出免疫应答，分泌肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor- α， TNF- α）、 白细胞介素-6（interleukin-6，ⅠL-6）、CD206 及ⅠL-10 等炎症因子，对神经系统起到既损伤又保护的双向作用［2］。MG 分为M1与M2型，不同类型的MG在ⅠS病程中发挥不同的作用。M1型分泌TNF-α、ⅠL-6等促炎症因子，加重ⅠS 的炎症反应，导致神经、组织进一步受损；M2 型分泌CD206、ⅠL-10等抗炎症因子，参与受损神经、组织的修复，对神经系统起到保护作用［3］。可见，调控MG向M2型转化对ⅠS的治疗具有重要意义［4］。但MG的M2型极化，目前尚缺乏有效的调控手段。

间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）已广泛用于受损组织的治疗，包括ⅠS 的救治［5］，其作用主要由MSCs 旁分泌的外泌体（exosomes，Exo）予以实现［6-7］。Exo 是细胞质膜萌芽到胞外基质中的一种膜囊泡，是介导细胞间对话的重要因子［8］。MSCs 旁分泌的 Exo 可致 M1 型巨噬细胞（macrophage，MP）与M1型MG转化为M2型，促使ⅠS受损神经的修复［9］。

微RNA （microRNA，miRNA） 具有高度保守性、高度组织特异性和相对稳定等特点，在细胞的生长、分化、凋亡及氧化应激等过程中发挥重要作用［10］，被认为是组织损伤的潜在生物标志物［11-12］。受损神经的重塑有多种miRNA 参与，其中，miR-124-1 可调控骨髓间充质干细胞（bone marrowmesenchymal stem cells，BMMSCs）的分化［13］，还可调控MG、MP 向M2 型转化［14-15］，在包括ⅠS 修复过程的神经发育及其功能调节中发挥作用。

为进一步提升MG 的M2 型极化调控效能，以利于ⅠS 患者的神经修复，本实验先分离、培养并鉴定大鼠BMMSCs 及其Exo（BMMSCs-Exo），然后构建miR-124-1 基因慢病毒过表达载体，将过表达miR-124-1 基因的BMMSCs-Exo（Exo/124-1）与经脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）活化的HAPⅠ小胶质细胞株（HAPⅠ细胞，一种MG）共培养。采用实时荧光定量 PCR （quantitative real-time PCR， qPCR） 和Western blotting分别检测HAPⅠ细胞的M1型分子（ⅠL-6、TNF-α）与M2型分子（CD206、ⅠL-10）的mRNA及其蛋白的表达变化。本实验旨在为研究BMMSCs通过其Exo携带miR-124-1基因调控MG的M2型极化在介导ⅠS神经重塑中的可能的机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物及细胞 分离BMMSCs 用SD 大鼠28 只［购自中国人民解放军陆军军医大学实验动物中心］，动物生产许可证号为SCXK（渝）20170002，使用许可证号为SYXK（渝）20170002。大鼠体质量200 g 左右，雌雄均有，于常规恒湿、恒温的SPF 级动物室内饲养，自由摄食标准饲料与无菌水。动物实验经重庆市第五人民医院伦理委员会批准（批号：2020CQSDWRMYYEC-dw001）。

HAPⅠ细胞购自深圳华拓生物科技有限公司。293T 细胞由中国人民解放军陆军军医大学复合伤研究所储存与惠赠。

1.1.2 主要试剂和仪器 胎牛血清购自美国Sigma公司；DMEM 培养基购自美国HyClone 公司；TNF-α、ⅠL-6、CD206、ⅠL-10 及CD9 抗体购自美国Abcam 公司；CD90、CD44 及CD45 抗体购自美国Ebioscience公司；CD63 抗体购自美国Scbt 公司；qPCR 检测引物由中国上海生工生物工程有限公司设计与合成，其检测试剂盒购自该公司，Bio-Rad CFX Manager 3.0为其定量分析软件；PVDF 膜购自美国Bio-Rad 公司；FT106 慢病毒载体、miR-124-1 基因合成及测序由中国广州辉腾生物科技有限公司提供与完成；胶回收及质粒抽提试剂购自美国Roche 公司；Lipofectamine®2000 基因转染试剂购自美国Ⅰnvitrogen 公司。CFX96荧光定量PCR 仪、Mini 蛋白电泳仪购自美国Bio-Rad公司；JEM-1400 Plus 透射电子显微镜（transmission electron microscope，TEM）购自日本HⅠTACHⅠ公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养与鉴定 BMMSCs 的分离、培养与流式细胞仪检测鉴定参照我们前期的实验［1］进行。HAPⅠ细胞按常规方法培养：待其生长至80%～90%融合时，消化传代培养，以备后用。293T 细胞采用常规培养。

1.2.2 BMMSCs-Exo的提取与鉴定 使用去掉Exo的含10%胎牛血清的DMEM培养基常规培养BMMSCs，传至第二代，至80%～90%融合时，收集、过滤其培养液。先在4 ℃时以300×g离心10 min，吸取其上清液；再在同样温度下，分别以2 000×g、10 000×g及100 000×g离心10 min、30 min及70 min，前2次为上清液离心，末次弃去上清液，收集沉淀（Exo）重悬于100 μL，4 ℃预冷的PBS液内，立即送样镜检。

取约10 μL Exo 悬液，按常规TEM 观察要求制样，3%磷钨酸水溶液染色，以100 kV 运行TEM 观察、拍照。

提取、定量Exo总蛋白，Western blotting法［1］检测其CD63 及CD9 蛋白的表达变化，内参照为GAPDH，至少重复3次。

1.2.3 FT106/miR-124-1 慢病毒载体的构建和鉴定参照miRBase 数据库的鼠源miR-124-1 基因序列（NR_031866.1），合成miR-124-1 基因，并克隆其入慢病毒载体FT106 的XbaI和BamHI酶切位点间，构建慢病毒重组载体FT106/miR-124-1，并行测序鉴定。

1.2.4 FT106/miR-124-1 重组载体的包装和滴度测定 参照重组慢病毒的包装与滴度测定实验［1］行FT106/miR-124-1重组载体的包装和滴度测定。

1.2.5 BMMSCs 的FT106/miR-124-1 病毒感染及其miR-124-1 基因的表达检测 BMMSCs 的FT106/miR-124-1 病毒感染参照干细胞的重组慢病毒感染实验［1］进行。设计miR-124-1（NR_031866.1）的qPCR 检测颈环引物（正向引物：5'-ACACTCCAGCTGGGCGT GTTCACAGCGGA-3'；反向引物：5'-CTCAACTGG TGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTCAAGG TC-3'）。qPCR 检测过表达miR-124-1 的BMMSCs（BMMSCs+miR-124-1，BMMSCs/124-1组）及其Exo的miR-124-1（BMMSCs-Exo+miR-124-1，Exo/124-1组）表达情况，以正常BMMSCs（BMMSCs 组）及其Exo（BMMSCs-Exo 组）的相同检测作对照。U6基因作内参。实验至少重复3次。

感染效率的评估采用表达绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的BMMSCs 的百分比及其qPCR 检测结果，表达GFP 90%以上者，说明其有效表达miR-124-1，可用于后续实验。

1.2.6 过表达miR-124-1的BMMSCs-Exo对MG极化调控的影响 常规培养HAPⅠ细胞，待其长至60%～70%融合时，更换含500 ng/mL 的LPS 培养基，24 h后，分别更换含10 μg/mL 的BMMSCs-Exo（Exo 组）及BMMSCs-Exo/124-1（Exo/124-1 组）培养基，再培养24 h，分别收集Exo 组与Exo/124-1 组细胞。用仅含LPS 培养基培养的HAPⅠ细胞（LPS 组）与未处理的HAPⅠ细胞（正常组）作对照。

设计、合成TNF-α（L00981.1）、IL-6（M26744.1）、IL-10（L02926.1）及CD206（NM_001106123.2）基因qPCR 检测引物（表1）。以各组细胞总RNA 为模板，qPCR分别检测各组细胞各基因的表达情况，以Gapdh（AF106860.2）为内参。

表1 qPCR检测的引物序列Tab 1 Primer sequences for qPCR

Western blotting 法［1］检测上述各组细胞TNF-α、ⅠL-6、CD206及ⅠL-10蛋白的表达情况。

1.3 统计学方法

采用SPSS 22.0 软件对数据进行分析。采用独立样本t检验与方差分析，数据以±s呈现。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 BMMSCs的分离、培养和鉴定

倒置显微镜观测发现，原代BMMSCs 由圆形向不规则形转变，随后大部分转变为长梭形、纺锤样，以散在集落状态分布。继续培养8～11 d，取单克隆BMMSCs 扩增培养。经扩增的BMMSCs 良好生长，待至85%～95% 汇片时再次传代扩增。此时的BMMSCs，大部分呈梭形，分布较均匀（图1），增殖旺盛，增殖速度明显快于原代，6～8 d 可再次传代培养，以备后用。

图1 镜下传代扩增的BMMSCsFig 1 BMMSCs subcultured and expanded under microscope

流式细胞仪检测证实，源于中胚层的细胞表型标志CD44 与CD90，在BMMSCs 中明显高表达，其阳性率分别为99.700%与99.200%；而造血细胞表型标志CD45，在BMMSCs中不表达或表达低下，其阳性率是0.999%（图2）。

图2 流式细胞仪检测BMMSCs的CD44(A)、CD90(B)与CD45(C)的阳性率Fig 2 Detection of the positive rates of CD44(A),CD90(B)and CD45(C)in BMMSCs by flow cytometry

2.2 BMMSCs-Exo的提取与鉴定

TEM 观察可见，BMMSCs-Exo 呈椭圆形、圆形囊泡状，直径50～150 nm（图3A）。Western blotting结果表明，其表面标志蛋白CD63、CD9 的表达分别较BMMSCs 增高68.00%与61.94%（图3B、3C），差异均具有统计学意义（P=0.000）。

图3 BMMSCs-Exo外泌体的鉴定Fig 3 Ⅰdentification of BMMSCs-Exo

2.3 FT106/miR-124-1病毒的测序鉴定

测序结果（图4）表明，携带miR-124-1 的重组病毒FT106/miR-124-1构建成功。

图4 重组慢病毒载体FT106/miR-124-1的测序鉴定Fig 4 Sequencing and identification of recombinant lentiviral vector FT106/miR-124-1

2.4 FT106/miR-124-1重组载体的包装和滴度测定

将重组病毒FT106/miR-124-1 感染常规培养的293T 细胞（图5A）。倒置荧光显微镜下可见，经感染48 h 的293T 细胞明显表达GFP（图5B）。倍比稀释法实验表明，该重组病毒的滴度约为1.4×108转导单位（transducing unit，TU）/mL。

图5 重组病毒FT106/miR-124的包装Fig 5 Recombinant lentiviral vector FT106/miR-124-1 packaged with 293T cells

2.5 BMMSCs的FT106/miR-124-1病毒感染

未感染的BMMSCs 无GFP 表达（图6A），被重组病毒FT106/miR-124-1 感染的BMMSCs，明显表达GFP（图6B），其感染效率达95%以上。qPCR 检测表明，被感染的BMMSCs 及其Exo 与感染前比较，其miR-124-1 的表达分别上调69.74%与70.59%，差异均具有统计意义（P=0.000，图6C）。

图6 BMMSCs及其Exo的重组病毒感染Fig 6 Recombinant lentivirus infection rate in BMMSCs and BMMSCs-Exo

2.6 携带miR-124-1 的BMMSCs-Exo 对MG 的M2型极化调控的影响

qPCR 和Western blotting 检测（图7、图8） 表明，Exo/124-1 能有效上调HAPⅠ细胞M2 型分子CD206（与正常组和LPS组比较，在基因水平分别上调了46.90%、76.99%，在蛋白水平分别为65.13%、85.11%）、ⅠL-10（与正常组和LPS 组比较，在基因水平分别上调了43.09%、72.36%，在蛋白水平分别为55.19%、78.18%），下调其M1 型分子ⅠL-6（与正常组和LPS 组比较，在基因水平分别下调了55.71%、73.04%，在蛋白水平分别为52.32%、76.95%）、TNF-α（与正常组和LPS 组比较，在基因水平分别下调了51.95%、 68.91%， 在蛋白水平分别为52.14%、77.47%） 的表达，差异均具统计学意义（P=0.000）。结果提示，过表达miR-124-1 基因的BMMSCs-Exo（Exo/124-1）可诱导M1 型HAPⅠ细胞向M2 型转化。

图7 qPCR检测过表达miR-124-1的BMMSCs-Exo对HAPI细胞CD206（A）、IL-10（B）、IL-6（C）和TNF-α（D）mRNA表达的影响Fig 7 Effects of overexpressing miR-124-1 gene in BMMSCs-Exo on the expressions of CD206, IL-10, IL-6 and TNF-α mRNA of HAPⅠcells detected by qPCR

图8 Western blotting检测过表达miR-124-1的BMMSCs-Exo对HAPI细胞CD206、IL-10、IL-6和TNF-α蛋白表达的影响Fig 8 Effects of overexpressing miR-124-1 gene in BMMSCs-Exo on the expressions of CD206, ⅠL-10, ⅠL-6 and TNF-α protein in HAPⅠcells detected by Western blotting

3 讨论

ⅠS 占脑卒中的70%～87%［1］。炎症反应在ⅠS 的发生发展中倍受关注。MG 被视为脑组织中的MP，是中枢神经系统（central nervous system，CNS）中首要和最主要的一道防线。静息状态的MG 对CNS 进行免疫监视，并通过移除细胞碎片、控制神经元及突触冲动等维持CNS的稳定。ⅠS炎症早期，MG被迅速活化成M1 型细胞，释放大量的炎症介质（ⅠL-6、TNF-α等），导致神经元变性、坏死［16］。本研究结果表明，经LPS 刺激活化的HAPⅠ细胞，其ⅠL-6、TNF-α表达明显上调，与文献报道相符；同时被活化成的M2 型细胞释放抗炎介质，发挥神经保护作用［17］。MG 既致毒又保护的双向作用成为ⅠS 救治的重要靶点，探讨MG 的M2 型极化调控成为ⅠS 治疗的新策略［4］，但目前仍缺乏有效的措施。因此，本研究选用HAPⅠ细胞为研究靶细胞，以寻求其M2 型极化调控的新手段，为更有效地治疗ⅠS奠定基础。

MSCs 是源于中胚层的成体干细胞，易于获取与扩增，具有高度自我更新与多向分化潜能，在各种疾病包括ⅠS的研究中得以广泛应用。Exo是细胞以出芽方式形成的一种直径30～150 nm 的双层脂质膜纳米囊泡。BMMSCs-Exo 可表达CD63、CD9 蛋白［18］。经TME 和Western blotting 鉴定表明，实验分离到的BMMSCs-Exo，其形态、大小及标志蛋白CD63、CD9 的表达等与文献报道一致。Exo 可向靶细胞传递其内容物（蛋白质、脂质及miRNA 等生物活性物），调控靶细胞基因的表达，影响其生物功能，介导细胞间的通信［19］。MSCs-Exo 不仅有MSCs 的特有活性物，且可作为新型免疫调节剂，免受治疗时细胞产生的免疫排斥，其应用前景广阔［20-22］。MSCs-Exo 在MG的M2型极化调控方面亦具一定作用。

miRNA 是小于22 个核苷酸的一类非编码RNA，参与调节细胞的增殖、凋亡、代谢及组织、器官发育等病理生理过程，其表达稳定、易于干预，作用迅速、广泛；在多种疾病，包括ⅠS 的研究中倍受关注［23］。因受双层膜结构的保护，Exo 中的miRNA 非常稳定。miR-124-1 是CNS 中最丰富的miRNA 之一，为总量的25%～48%［24］，可促进MSCs 行使炎症免疫调节和神经保护作用［25］。ⅠS发生后，miR-124-1能使MG 向M2 型极化，以防神经元受损；但单纯地应用miR-124-1，其促进MG 的M2 型极化效能并不显著［15，26］。因此，我们在研究中采用BMMSCs-Exo 携带miR-124-1 来干预HAPⅠ细胞。本研究证实，BMMSCs-Exo 能携带miR-124-1，显著上调HAPⅠ细胞的CD206、ⅠL-10表达，提示其可有效诱导HAPⅠ细胞向M2型极化。

综上所述，BMMSCs 可经其Exo 携带miR-124-1基因，促使HAPⅠ细胞向M2 型细胞极化，从而可能介导ⅠS 神经功能的恢复。本实验只在细胞水平进行了初步探讨，其动物及临床结果是否符合预期，需进一步研究证实。