多株光合细菌混合培养条件优化及生长动力学分析

卫燕红，白红娟，薛海龙，杨官娥，吕 宁，胡锦俊，宋 雨

(1. 中北大学 环境与安全工程学院，山西 太原 030051； 2. 华晋瑞海科技有限公司，山西 太原 030002；3. 山西医科大学 药学院，山西 太原 030001)

0 引言

光合细菌(Photosynthetic Bacteria，PSB)是具有原始光能合成体系的原核生物，能够在厌氧光照条件下，以小分子有机化合物或二氧化碳为碳源进行不放氧光合作用[1]，特别是紫色非硫菌群，不仅能在厌氧光照的条件下进行光能异养生长，而且能在有氧黑暗条件下进行好气异养生长，即具有随着生存环境而灵活改变代谢类型的特性[2]. 光合细菌中的球形红细菌含有多种营养物质，如蛋白质、多种B族维生素、辅酶Q等生理活性物质，能分解苯及其衍生物类有机污染物，修复铅、镉和铬污染土壤[3-4]； 沼泽红假单胞菌在不同的自然环境下能表现出不同的生理生化功能，如固氮、产氢、分解有机污染物和修复镉、砷污染土壤等，在自然界的氮、碳、硫循环中发挥着重要的作用[5-6]； 深红红螺菌不仅能够合成聚羟基脂肪酸酯(PHA)，还能提高土壤肥力和促进植物生长，修复铅、汞和铬等重金属污染土壤[7]. 然而，在实际应用过程中，纯菌株对原材料、设备和能源的利用率较低，功能单一，且易染杂菌[8]. 因此，为解决上述问题，采用混合培养方法制成含有球形红细菌、沼泽红假单胞菌和深红红螺菌等3株光合细菌的复合菌剂，为光合细菌应用于修复多种有机污染物和多种重金属复合污染提供支持.

菌种混合培养不仅活菌数远远高于纯种培养，生理代谢功能也会增强[9]. 范金霞等[10]对4种纤维素降解菌进行单独和混合培养时发现，混合培养产生的纤维素酶活力最高，充分说明了纤维素菌混合培养能够提高纤维素的降解率. Nguyen等[11]采用酵母菌-醋酸菌混菌培养时发现，混菌培养可显著提高活菌数和生理代谢功能. Nookongbut等[12]研究发现，在镉、砷污染严重的土壤中，施用光合细菌中的沼泽红假单胞菌、胶质红假单胞菌、粪假单胞菌、苯甲酸盐红长命菌在使小麦、菜豆、烟草、水稻等作物稳产的同时降低了作物对重金属的吸收，比单一菌的实施效果更好.

目前，有关微生物混合培养的研究较少，且已有的报道大多数以获取发酵产物为目的[13]，以获取菌株为目的并且探究混合培养过程中菌株生长过程的研究较少. 为此，本文以球形红细菌(H菌株)、沼泽红假单胞菌(N菌株)和深红红螺菌(M菌株)为研究对象，探究光合细菌混合培养的生长规律，以期缩短培养时间，提高光合细菌的活菌数，为光合细菌混合菌剂的制备提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌种

球形红细菌(Rhodobactersphaeroides，H菌株)、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris，N菌株)和深红红螺菌(Rhodospirilliumrubrum，M菌株)系光合细菌中的紫色非硫菌群，由山西大学光合细菌研究室分离、鉴定并提供[14].

1.1.2 试剂

苹果酸，(NH4)2SO4，MgSO4，CaCl2等均为分析纯； 酵母膏为生物试剂. 以上试剂均由天津市科密欧化学试剂有限公司生产.

1.1.3 培养基

光合细菌(PSB)培养基：苹果酸2.5 g，酵母膏1.0 g，(NH4)2SO41.25 g，MgSO40.2 g，CaCl20.07 g，K2HPO40.9 g，KH2PO40.6 g，用NaOH将pH值调为7，蒸馏水1 000 mL，121 ℃，103.4 kPa下高压蒸汽灭菌20 min.

1.2 仪器与设备

主要实验仪器与设备如表 1 所示.

表 1 主要仪器与设备一览表Tab.1 The main instruments and equipment list

1.3 方法

1.3.1 PSB单一菌和混合种子液的制备

将H菌株、N菌株和M菌株按15%(体积比)的接种量分别接种到250 mL血清瓶中，用培养基填满血清瓶，并用橡胶塞封口，在温度为30 ℃、光照度为2 500 lx的光照培养箱中静置培养48 h. 连续活化两次后采用平板菌落计数法测定各自活菌数，保存在4 ℃冰箱中作为备用单一菌. 将3种菌株按 1∶1∶1(活菌数比)混合均匀即为PSB混合种子液.

1.3.2 不同理化因素对PSB混合菌生长的影响

将PSB混合种子液接种到250 mL血清瓶中，用培养基填满血清瓶，并用橡胶塞封口. 每隔6 h测定PSB混合菌的活菌数. 设定接种量(接种后的初始培养菌含量分别为7×108CFU/mL, 1.2×109CFU/mL, 1.7×109CFU/mL, 2.2×109CFU/mL，2.7×109CFU/mL)，初始pH值(分别为5, 6, 7, 8, 9)，培养温度(分别为20 ℃, 25 ℃, 30 ℃, 35 ℃, 40 ℃)，光照供氧(分别为光照厌氧、光照好氧、黑暗厌氧和黑暗好氧)等条件进行优化试验，分别考察不同理化因素对混合菌株生长的影响. 厌氧条件采用光照培养箱静置培养； 好氧条件采用摇床(振荡速度为130 r/min)培养； 光照度为2 500 lx； 黑暗条件采用7层黑布包裹. 采用稀释涂布平板法(吸取0.1 mL菌液于培养皿涂布均匀，晾干后将培养皿置于温度为 30 ℃、光照度为2 500 lx的人工气候箱，培养120 h 后数活菌数)测定菌株数，每次试验做3个平行.

1.3.3 动力学模型的建立

选择修正的Gompertz[15]方程式对实验数据进行拟合，见式(1).

(1)

式中：t为时间，h；yt为t时刻的菌液浓度，CFU/mL；ymin为最小菌液浓度，CFU/mL；A为菌数增长的对数值；μmax为最大比生长速率，h-1；λ为延滞期，h.

将式(1)经过变形得到式(2)，即

(2)

在不同条件下，每隔6 h测定PSB混合菌的活菌数，结合式(2)进行非线性回归后建立不同条件下的生长动力学模型，分别考察接种量、初始pH、温度及光照供氧对PSB混合菌生长的影响，并探究在本文研究的适宜条件下PSB单一菌和混合菌的生长曲线和动力学参数，方程拟合度由R2进行评估.

1.3.4 数据处理

按照修正的Compertz 模型进行生长动力学拟合.

2 结果与讨论

2.1 PSB混合菌培养条件的优化

2.1.1 接种量对PSB混合菌生长的影响

不同接种量下，PSB混合菌生长曲线如图 1 所示. 当接种量由7×108CFU/mL增加到1.7×109CFU/mL时，随着接种量的增加，活菌数也随之增加； 接种量为1.7×109CFU/mL时48 h到达稳定期，此时的活菌数为7.03×109CFU/mL. 当接种量由1.7×109CFU/mL继续增大到2.2×109CFU/mL时，活菌数反而下降. 当接种量为2.7×109CFU/mL时，虽然接种量最大，但培养效果最差，在48 h时活菌数仅为6.08×109CFU/mL. 这可能是由于培养环境中营养物质不足以供应细菌的生存，菌体间竞争加剧，导致生存环境恶劣，使一部分菌被淘汰或者提前进入衰老期[16]. 另外，接种量达到上限，此时接种量已经不再是影响细菌生长的主要因素[17]. 总体来说，接种量对活菌数没有显著影响，当接种量为 1.7×109CFU/mL时，菌株的生长情况最好，而过多的接种量并不能有效提高活菌数, 反而会增加成本. 综合考虑, 本文采用1.7×109CFU/mL 作为最适接种量.

图 1 接种量对PSB混合菌生长的影响Fig.1 Effect of inoculation quantity on the growth of PSB

2.1.2 培养基初始pH值对PSB混合菌生长的影响

不同初始pH值下PSB混合菌生长的情况如图 2 所示.

图 2 初始pH值对PSB生长的影响Fig.2 Effect of initial pH on the growth of PSB

由图 2 可知，PSB混合菌受pH值影响显著. 初始pH值为5和9时，PSB混合菌生长缓慢，54 h 到达稳定期，且各自的活菌数分别为3.81×109CFU/mL和4.16×109CFU/mL. 除此之外，混合菌在pH值为9的培养基中，还生成了一些絮状物. pH值为6时的菌株生长情况也较差，说明光合细菌不适合在酸性环境下生存. 当pH值为8时，细菌菌液浓度略低于pH值为7时的菌液浓度，但总体生长情况良好. 当pH值为7时，混合菌的生长速度最快，48 h达到稳定期，活菌数也最高，为7.03×109CFU/mL. 所以，PSB混合菌适合在中性或弱碱环境中生存. 分析原因为pH值的升高打破了培养基中离子间的化学平衡，使化学平衡发生移动，故有絮状物产生，导致培养基中的无机盐浓度降低，故菌种的活性降低[18]. 除此之外，pH值过高和过低都会破坏酶和各种生物大分子的稳定，使细胞生物活性降低，或者引起细胞膜电荷的变化，影响微生物对营养物质的吸收[19-20].

2.1.3 培养温度对PSB混合菌生长的影响

不同培养温度下PSB混合菌的生长曲线如图 3 所示，可以看出PSB混合菌受温度影响显著. 当温度为20 ℃和25 ℃时，混合菌生长缓慢，分别在66 h和54 h到达稳定期，此时的活菌数分别为4.07×109CFU/mL和5.38×109CFU/mL； 当温度为35 ℃时，混合菌的生长情况良好，生长较快，但35 ℃时菌液浓度略低于30 ℃； 当温度为40 ℃时，混合菌生长最慢，在54 h到达稳定期的活菌数仅为3.73×109CFU/mL. 分析原因[8]，其一可能是因为随着温度的升高，有些菌株生长过快提前进入衰亡期，影响菌株的生长周期，混合培养产物中活菌数降低； 其二是因为超过35 ℃时，菌体就会有自溶的风险； 其三是温度过高或过低都会影响酶的活性，进而影响各种生化反应的速率，影响微生物的生长. 综上所述，30 ℃时PSB混合菌的生长情况最好，活菌数最大，所以选择30 ℃作为PSB混合菌的培养温度.

图 3 温度对PSB生长的影响Fig.3 Effect of temperature on the growth of PSB

2.1.4 光照供氧对PSB混合菌生长的影响

各光照供氧下PSB混合菌的生长曲线如图 4 所示，可以看出PSB混合菌受光照供氧影响较显著. 在光照厌氧条件下，PSB具有类似叶绿体的光反应中心，PSB混合菌利用光能进行厌氧生长，菌液由淡红色变为深红色，且生长情况最好，生长速率最快，48 h进入稳定期后活菌数也高于其他3种情况，为7.03×109CFU/mL. 在光照好氧条件下，PSB混合菌的菌液呈现淡红色，菌株虽有生长，但生长较缓慢，54 h进入稳定期的活菌数为6.29×109CFU/mL，分析原因为氧气抑制了细菌叶绿素和类胡萝卜素的生成，靠消耗自身合成的有机物产生能量，改变了代谢途径[21]，所以, PSB混合菌生长速率减慢. 在黑暗好氧和黑暗厌氧条件下，PSB虽然无法进行光合作用，但菌株也可以生长. 总的来说，PSB具有在不同生长环境下灵活改变代谢的特性.

图 4 光照供氧对PSB生长的影响Fig.4 Effect of illumination and oxygen supply on the growth of PSB

2.2 PSB的生长动力学分析

在菌体生长动力学中，一级生长动力学模型是一个数学方程或数学函数，表示微生物数量与时间的关系，包括初始菌数、迟滞期、生长速率、细菌最大浓度等与时间变化之间的关系. 目前，常用的细胞生长动力学模型有Monod方程、Logistic方程、修正Gompertz方程等. Monod方程、Logistic方程的模型应用比较方便，但都不能很好地模拟细胞生长的整个过程，特别是延迟期. 在使用过程中，Monod方程忽略了底物浓度对细菌生长的限制作用，而Logistic方程是以指数函数为基础，准确性不高[22]. 本文选择修正的Gompertz方程分析不同培养条件对PSB混合菌的最大比生长速率和延滞期的影响及其生长曲线.

2.2.1 不同培养条件对PSB混合菌生长的影响

不同的接种量、初始pH值、培养温度及光照供氧的动力学方程及参数见表 2～表 5. 从表中可以看出，本试验条件下的生长动力学均符合修正的Compertz动力学模型. 由表 2 可以看出，随着接种量从7×108CFU/mL增至1.7×109CFU/mL，PSB混合菌的最大比生长速率μmax逐渐增大，延滞期λ逐渐减小，继续增大接种量，结果却相反.

表 2 不同接种量下PSB混合菌的生长动力学Tab.2 Growth kinetics of PSB mixed bacteria under different inoculation quantity

由表 3 可以看出，当初始pH值从5增加到7再到9时，最大比生长速率从0.009 h-1增加到 0.025 h-1再降到0.01 h-1，延滞期从17.8 h减小至9.9 h 再增大至19.1 h，在pH值为7时PSB混合菌的最大比生长速率最大，延滞期最小，说明PSB混合菌适合在中性条件下生存. 由表 4 可以看出，随着温度从20 ℃增至30 ℃，PSB混合菌的生长速率μmax逐渐增大，延滞期λ逐渐减小，再增大温度时，结果则没有在30 ℃的情况好. PSB混合菌在30 ℃下生长最好. 由表 5 可以看出，在厌氧光照条件下，PSB混合菌的最大比生长速率最大，为 0.025 h-1，延滞期最短，为9.9 h.

表 3 不同初始pH值下PSB混合菌的生长动力学Tab.3 Growth kinetics of PSB mixed bacteria under different initial pH

表 4 不同温度下PSB混合菌的生长动力学Tab.4 Growth kinetics of PSB mixed bacteria under different temperature

表 5 不同光照供氧下PSB混合菌的生长动力学Tab.5 Growth kinetics of PSB mixed bacteria under different illumination oxygen supply

2.2.2 PSB的生长曲线分析

在接种量为1.7×109CFU/mL，初始pH值为7，温度为30 ℃，厌氧光照的条件下，分别培养PSB单一菌和混合菌96 h. 采用修正的Compertz动力学模型进行拟合，生长动力学曲线拟合及动力学参数见图 5 和表 6.

图 5 PSB单一菌和混合菌生长动力学曲线Fig.5 Growth kinetics curves of PSB single and mixed bacteria

如图 5 所示，拟合值与实验结果基本保持一致，拟合菌体生长曲线与测得的实验值保持同步变化，且都存在一个延滞期，随后进入指数生长期，最后到达稳定期. 除此之外，H菌株、N菌株和M菌株分别在54 h到达稳定期，而混合菌在48 h到达稳定期，比单一菌株提前了6 h. 在48 h时，混合菌的活菌数为7.03×109CFU/mL，较H菌株、N菌株和M菌株3种单一菌株的活菌数分别提高了15.2%, 21.2%和23.3%，表明混合培养能够促进细菌的生长.

将表6中菌种纯种培养和混合培养时的生长特征参数进行比较发现，混合后PSB混合菌的最大比生长速率μmax较H菌株、N菌株和M菌株3种单一菌株分别增大了 0.003 h-1，0.006 h-1及0.003 h-1，延滞期λ分别减小了11.1 h，12.7 h 及10.6 h，极大地提高了生产效率，缩短了培养时间.

表 6 PSB的生长动力学Tab.6 Growth kinetics of PSB

3 结 论

接种量、初始pH值、培养温度和光照供氧对PSB混合菌的生长都有不同程度的影响，优化后的适宜培养条件为：接种量(接种后的初始培养菌含量)为1.7×109CFU/mL，初始pH值为7，温度为30 ℃和光照厌氧. 通过建立菌体生长动力学模型，模拟培养过程中菌体的动态变化过程，混合培养前后动力学模型的预测值和实测值拟合效果良好(R2均大于0.95)，所建模型能较好反映混合菌和单一菌培养过程中的动力学变化. 在最优条件下，混合菌培养48 h到达稳定期，比H菌株、N菌株和M菌株3种单一菌株的稳定期均提前 6 h，此时混合菌活菌数为7.03×109CFU/mL，比单一菌株H菌株、N菌株和M菌株分别提高了15.2%，21.2%和23.3%.