mVOCs在根际免疫中的研究进展及思考

王佳宁，韦中，RAZA Waseem，江高飞，徐阳春，沈其荣

（江苏省固体有机废弃物资源化高技术研究重点实验室，国家有机类肥料工程技术研究中心，江苏省有机固体废弃物资源化协同创新中心，南京农业大学资源与环境科学学院，南京 210095）

根际生态系统所具有的抵御土传病原菌入侵并维持植物健康的现象和能力被称为根际免疫，其核心是在植物根系周围形成抵御病原菌入侵、定殖和致病的第一道生物防线——根际有益微生物群落。根际有益菌产生的次生代谢产物是其提升根际免疫能力的重要物质基础。这些活性物质可以直接抑制土传病原菌在根际的增殖、扩散和致病能力，还可以调节有益微生物群落互作关系进而影响微生物群落的抑病能力。此外根际有益菌产生的活性物质还可以诱导植物系统抗性，提高植物免疫能力。微生物分泌的活性物质可简单分为非挥发性有机物（Non-volatile organic compounds，NVOCs）和易挥发性有机物（Microbial volatile organic compounds，mVOCs）两类，其中mVOCs 是微生物在代谢过程中产生的一类分子量低（<300 Da）、蒸气压高、沸点低且通常具亲脂属性的化合物。mVOCs 是微生物自身利用蛋白质、脂肪和碳水化合物等大分子物质生成葡萄糖、氨基酸和脂肪酸等小分子代谢产物，再通过初级代谢和次级代谢将这些物质转化形成的。目前发现的mVOCs 种类多样，包括烷、烃、醇、醛、酮、酯、酚、杂环化合物和苯衍生物。部分mVOCs 具有抑制病原菌的作用，且有长距离传播、低浓度可被感知的优点，作为根际微生物产生的重要次生代谢产物，人们逐渐重视其在提升根际免疫能力中的重要性。目前关于mVOCs 促进植物生长和控制采后果蔬病害的潜力已得到了较好的重视和归纳，但mVOCs在提升根际免疫中的作用效果和机制研究还比较匮乏，并且缺少系统梳理。

为此，本文首先介绍mVOCs 参与土壤抑菌性的发现过程，系统梳理抑制土传病原菌的mVOCs 及分泌源——有益微生物。其次，从抑制土传病原菌生长和致病能力，调控根际微生物群落结构、互作和功能，以及激发植物抗性等3 个方面详细阐述mVOCs 影响根际免疫的机理。随后，总结mVOCs 在防控土传病害中的应用现状，分析影响mVOCs 产生及作用效果的土壤生物和非生物因素。最后，从研究方法、作用机理和产业化瓶颈等方面提出一些mVOCs 与根际免疫相关研究的思考和展望，呼吁有关科技工作者关注mVOCs在根际免疫领域的理论和实践价值。

1 发现mVOCs 具有抑制病原菌作用的过程及关键微生物

20世纪50年代人们注意到一些土壤具有抑制真菌萌发和生长的特性（Soil fungistasis）。随后发现灭菌后土壤的真菌抑制作用会显著降低，人们逐渐认知到微生物在土壤抑真菌性过程中发挥重要作用。DOBBS 等最先提出微生物产生抑菌物质是土壤表现出抑真菌性的关键原因，随后这一观点逐步被证实。有研究发现，在与真菌无直接物理接触的情况下，抑真菌性土壤仍可抑制真菌的生长，表明这类土壤会产生具有抑制真菌生长的挥发性物质。结合此前ZOLLER 等证实的细菌能够产生易挥发性物质，使得人们越来越多地关注和重视mVOCs 在土壤抑菌性中发挥的作用。2004 年，云南大学张克勤团队证明抑制真菌土壤与mVOCs 密切相关，但未明确哪些微生物发挥了作用；2007 年，该团队对普遍抑制真菌孢子萌发和生长的土壤进行分析，发现、、、和等细菌能产生显著抑制真菌和孢子萌发和菌丝生长的mVOCs，并通过质谱分析鉴定出了7 种抑制真菌生长的关键mVOCs 成分（acetamide、benzaldehyde、benzothiazole、1-butanamine、methana⁃mine、phenylacetaldehyde 和 1-decene）。这些发现给人们一个重要启示：mVOCs 可能是土壤抑菌性的重要来源，可以用于抑制土传病原菌。

自从了解到mVOCs 具有抑制微生物生长的能力后，人们尝试分离筛选出能产生抑制植物土传致病菌mVOCs 的有益微生物。目前已确定多种细菌或真菌可以产生抑制病原真菌的mVOCs（表1），其中和属细菌mVOCs 的抑菌能力被研究得最为广泛。如所产生的mVOCs既能抑制病原真菌菌丝的生长，也能抑制病原细菌的生长和致病能力；产生的 mVOCs能抑制病原真菌和病原细菌ssp.；具备抑制病原细菌和的能力。此外、、、属细菌均被发现可以产生抑制病原真菌和病原细菌的mVOCs。可产生抑制土传病原菌的mVOCs 的真菌多发现于植物内生菌中，如植物内生真菌sp.的mVOCs 具有抑制、和等多种植物病原真菌的活性能力。以上研究表明大量有益微生物产生的mVOCs 对各类土传植物致病菌均有抑制能力，这些微生物可以用于开发生防菌剂，提升根际免疫能力。

表1 具有抑制土传病原真菌和细菌的mVOCs及其微生物分泌源Table 1 Reports on mVOCs that could inhibit the growth of fungal or bacterial pathogens

2 mVOCs在根际免疫中的抑菌机制

土传病原菌根际入侵主要有3 个步骤：（1）从土体向根际迁移；（2）在根际大量定殖生长；（3）在根表形成生物膜，表达致病基因。mVOCs 在这3 个过程中均发挥重要作用：一是mVOCs 直接作用于土传病原菌，二是通过影响其他微生物间接抑制病原菌，三是诱发植物免疫（图1）。

图1 mVOCs抑制土壤病原菌入侵植物根际的机制Figure 1 The mechanisms of mVOCs inhibiting the rhizosphere invasion of soil pathogens

2.1 减弱土传病原菌入侵根际过程中的致病能力

感知寄主植物和向根际定向运动是土传病原菌根际入侵的第一步。由于具有易挥发性，mVOCs 能通过土壤颗粒之间的空隙进行扩散，因此mVOCs 不需要与目标病原菌直接物理接触就能发挥其抑制活性。一项测定mVOCs 在土壤中扩散距离的实验中，发现60 min 内多种mVOCs 均可以扩散至距释放源12 cm 的区域；尽管发现随扩散距离的延长，mVOCs 的浓度会呈现降低的趋势，但这种扩散能力取决于mVOCs化合物本身。结合mVOCs通常在较低浓度便能发挥作用的特点，可以推断mVOCs抑制病原菌的范围可以从根际扩大至土体中。此外，一些mVOCs 具有直接降低病原菌对寄主植物的感知或是抑制病原菌运动能力的功能，从而阻碍土传病原菌向根际迁移。例如产生的glyoxylic acid 和2，3-butanedione 等 mVOCs 可下调与趋化和运动相关的30 个基因。根际所产生的mVOCs 能显著抑制趋化、泳动、颤搐等生理特征以及相关基因的表达。

向根际迁移之后，土传病原菌需要大量增殖，占据生态位，这是其根际入侵的第二步。根际有益微生物可通过mVOCs 抑制土传病原菌的营养资源利用和竞争能力，从而抑制土传病原菌种群数量在根际的大量增长。例如，一些mVOCs 可抑制病原真菌孢子形成和菌丝发育，阻碍病原真菌的营养吸收与繁殖。RAZA 等研究发现，T-5 产生的mVOCs能显著降低菌落直径的大小。D13 菌株的mVOCs 能显著降低pv.的生长和细胞活力。

群体感应是细菌根据种群内部释放的信号物质的浓度而启动特定基因表达的一类交流方式，许多病原菌生物膜形成依赖于群体感应。群体感应是土传病原菌毒性表达的重要信号，标志着土传病原菌的根际入侵进入第三个阶段。干扰或阻止病原菌种群内部群体感应，即群体感应淬灭，能起到抑制病原菌毒性表达的作用。CHERNIN 等发现B-4117 和IC1270 产 生 的mVOCs 能抑制多种细菌群体感应信号分子的产生，这些细菌包括、、和。PLYUTA 等在探究两株spp.产生的mVOCs 对土传病原细菌生物膜形成影响的试验中，发现菌株449 和B-4117 产 生 的 酮 类mVOCs（2-nonanone、2-heptanone和2-undecanone）均能抑制生物膜的产生，并能杀死成熟细胞膜中的细菌。但值得注意的是，一些mVOCs 也可能作为信号物质或胁迫因子诱导或激发细菌生物膜的产生，形成对某类抗生素的抗性。如果病原菌获得这一能力，可能会不利于土传病害的防治。因此，探明mVOCs 不同成分对土传病原菌在根际入侵过程中生存和与毒性相关特征的影响非常重要。

2.2 mVOCs通过影响菌群互作抑制病原菌根际入侵

土壤微生物与周围环境的作用是相互的，即微生物会通过调节代谢产物的分泌（包括mVOCs）来适应所处微域的生物或非生物条件，其分泌的代谢物质也会反过来影响周围环境。因此mVOCs 除了可以直接抑制病原菌，还有可能通过影响其他土壤微生物的生长和代谢，间接抑制土传病原菌的根际入侵。YU⁃AN 等研究发现，NJN-6 产生的mVOCs 能 显 著 增 加 Proteobacteria、Bacteroidetes 和Firmicutes 门细菌的相对丰度；其中Proteobacteria 门属细菌的丰度变化显著，该属细菌常被作为病原菌的拮抗菌，且其广泛存在于抑病型土壤中，这说明mVOCs 可能通过提高病原菌拮抗菌的丰度来增加微生物群落对病原菌的抑制作用。一些mVOCs 可能作为信号物质诱导自身或其他微生物产生抗生素或其他抑菌类物质间接抑制土传病害的发生。产生的mVOCs能增加次级代谢产物的产生，这些次级代谢产物可以抑制sp.的活性，表明微生物间可能通过释放mVOCs 形成合作关系，从而增加群体战胜竞争对手或病原菌的机会。LUTZ 等发现，释放的 mVOCs 会增加合成抗菌物质（2，4-diacetylphloroglucinpl）基因的表达。

2.3 mVOCs诱导植物增强对病原菌根际入侵的防御

土传病原菌在根际成功定殖后，通过群体感应调控种群中个体启动毒性因子合成和分泌系统，这些毒性因子可以裂解植物细胞壁、干扰植物系统免疫，从而入侵并定殖于植物根内。因此，在土传病原菌成功入侵根际后，有益菌能否激发作物免疫能力对植物健康非常重要。有益菌mVOCs 可以作为信号物质激发植物免疫系统，从而抵御土传病原菌的进一步入侵。RYU 等报道了有益菌释放的mVOCs 可诱导拟南芥的系统抗性，发现GB03 和IN937a 产生的 2，3-butanediol 可显著提高拟南芥对病原细菌subsp.的抵抗力。此外，E681 产生的tridecane 能特异性提高拟南芥水杨酸和乙烯信号基因的转录和表达，从而诱导系统抗性。GB03 释放的mVOCs 通过诱导拟南芥系统抗性而非抑制病原菌生长来保护拟南芥免受感染；实时定量PCR 结果表明释放的mVOCs增强了拟南芥PR1 和PDF1.2 的表达，激发了植物系统抗性，从而抑制了病原菌的定殖。拟南芥预先接触产生的6-pentyl-α-pyrone，可以减轻和感染时的发病症状，说明产生的mVOCs 能提高拟南芥对病原菌的抵抗能力。TAHIR等研究发现，spp.产生的 mVOCs 能诱导 EDS1 和 NPR1等与植物系统抗性中水杨酸途径相关的基因过表达，进而提升烟草抗入侵能力。RAZA等在研究产生的 mVOCs 抑制入侵番茄根际的研究中发现，mVOCs 能诱导番茄植株抗氧化酶如超氧化物歧化酶、多酚氧化酶和过氧化物酶的活性，植物免疫能力显著提高。目前关于mVOCs诱导植物抗性的研究主要聚焦在提高植物自身免疫系统上，但在mVOCs是否会诱导植物根系释放干扰土传病原菌趋化运动、抑制病原菌生长和定殖以及调控根际微生物组的物质方面尚缺乏系统研究。

3 mVOCs抑制土传病害的效果及影响因素

3.1 mVOCs抑制土传病害的应用效果

mVOCs 表现出的抑制土传病原菌的能力，使其逐渐成为防控土传病害的一种新型武器。目前，一些田间试验结果也证实了mVOCs 的生防效果。KONG 等将番茄幼苗用土壤细菌产生的2，3-bu⁃tanediol 预处理后，移栽到病毒病障碍田块，发现植株病毒病的发病率显著降低。类似的应用发现，2，3-butanediol 可以增强玉米植株对病原真菌的抗性，3-pentanol 和 2-butanone 可以减轻田间条件下黄瓜植株受感染的症状。另一种田间应用mVOCs 的方式是将有抑菌功能的mVOCs 成分作为熏蒸剂。目前，具有抑制土传病原菌和线虫功能的释放的di⁃methyl disulfide（DMDS）是温室条件和大田条件下最为常用的mVOCs 熏蒸剂，目前已成功转化为商品化土壤熏蒸剂产品PALADIN（Paladin Technical EPA Reg. No. 55050-.3）。但是作为化学熏蒸剂使用有其弊端，如挥发性高、稳定性差以及可能对非目标菌产生“副作用”。一种替代直接施入熏蒸剂的方式是向土壤施入能促进抑菌mVOCs 产生的有机肥，该方法可以延长mVOCs的作用时间。

3.2 影响mVOCs产生和抑病效果的因素

土壤非生物条件会对mVOCs 的产量、组成和功能产生重要的影响，如温度、pH、水分含量和土壤质地等，因此mVOCs的抑菌功能也可能受到这些因素的影响。如JONES 等发现，环境pH 升高会诱导提高有抑制土壤细菌和活性的trimethylamine 的释放。氧气含量也会通过改变土壤微生物的组成而影响土壤中发挥抑制病原菌作用的mVOCs 的产生。如VAN AGTMAAL 等发现在对土壤进行厌氧消毒处理后，土壤中 Acidobacteria、Planctomycetes、Nitrospi⁃rae、Chloroflexi 和 Chlorobi 门细菌的相对丰度显著降低，导致抑制植物病原菌Pythium 的mVOCs 产量降低、土壤的抑菌功能下降。此外，养分资源可利用性也对mVOCs 的产生和功能有重要的影响。LAZAZ⁃ZARA 等发现，在蛋白质丰富的培养基中菌株会产生有抗线虫活性的mVOCs，而在糖分丰富的培养基中则不会产生。由于土壤的养分条件会影响土壤微生物的代谢方式，因此土壤养分的丰富度和多样性会通过影响土壤微生物的丰富度和多样性，从而影响mVOCs产生的丰富度和多样性。

除非生物因素外，产mVOCs 的微生物本身的生长、微生物种内和种间的互作关系以及相关的植物也是影响mVOCs 产生和抑菌能力的关键因素。分泌抑菌mVOCs 的微生物的生长阶段会影响所产mVOCs的抑菌效果。如植物内生真菌在培养基中生长1 d所产的mVOCs对的抑制率为49.2%，2~15 d的抑制率达到100%，16~17 d的抑制率出现下降的趋势。在拮抗关系为主导的芽孢杆菌群落中，种群多样性的增加会增加新型mVOCs 的产生，包括可以抑制的mVOCs。在处于竞争关系的真菌间，和会产生能高效抑制病原真菌和生长的 mVOCs。在原生动物与真菌或细菌的捕食关系中，研究发现真菌和细菌产生的mVOCs 不只具有指引原生动物捕食的作用，还具备抵御捕食者的作用。如KAI 等发现、等细菌产生的 mVOCs 可以抑制原生动物的生长，但原生动物的存在是否驱动了细菌或真菌特定的mVOCs的产生还有待进一步研究。此外，植物健康与根际微生物群落构成密切相关，但植物是否会通过刺激根际有益菌释放抑菌型mVOCs 来影响根际微生物群落还缺乏关注。

4 总结与展望

土壤微生物在帮助植物应对各种逆境、促进其健康生长中发挥重要作用。土壤微生物产生的mVOCs作为生态友好的化学资源，可以作为合成农药的重要资源，以mVOCs 为核心的产品和技术必定在绿色可持续农业发展中占据一席之地。值得强调的是，尽管mVOCs 在根际免疫研究中已取得一些进展，但相关研究的证据链条的完整性还较为缺乏，其应用仍然面临着多方面的挑战。以下从mVOCs 研究体系、mVOCs 在根际免疫中的作用机制和产业化困境等方面列出一些思考（图2）。

图2 关于mVOCs研究和应用的展望Figure 2 Summary of future research and application directions of mVOCs

（1）土壤mVOCs研究体系的优化

目前研究mVOCs 普遍采用的方式为通过分割平板实验确定菌株mVOCs 的功能特性后，采用固相微萃取（Solid phage microextraction，SPME）收集mVOCs，再利用气相-质谱连用仪（GC-MS）、离子流动管质谱法（SIFT-MS）或质子转移反应质谱法（PTR-MS）进行成分鉴定和分析。这种研究体系虽然可以为我们提供mVOCs 的基本信息，但是忽略了真实环境特性的复杂性。mVOCs 的特性和功能易受到各种生物和非生物因素的影响，因此未来研究mVOCs 的平台应该尽量模拟真实的土壤环境，再结合更灵敏、更广谱的检测设备，从而可更加全面地探究和理解土壤特性、物理条件、生物群落、植物根系等与mVOCs 功能之间的关系。此外，缺乏对mVOCs 产生机制的深入探究，结合分子生物学手段实时定量分析mVOCs 的产生与基因表达之间的关系，有助于从分子水平上理解mVOCs的产生机制和规律。

（2）mVOCs在根际免疫中发挥作用的理论创新

土壤微生物组与植物健康密切相关，mVOCs 作为信号物质可能介导了微生物-植物互作，如土传病原菌或有益微生物与植物互作是否会抑制或激发植物免疫，信号途径是什么？此外，mVOCs 作为可长距离作用的物质，不仅能介导微域内微生物-微生物互作，还可能参与土体微生物与根际微生物之间，以及地下微生物与地上微生物之间的互作，进而影响根际免疫能力。因此，土壤mVOCs 可能作为一种全局化的力量影响土体微生物组-根际微生物组-植物微生物组间的交流，从而影响作物健康。丰富和完善土壤mVOCs在根际免疫中发挥作用的机制是mVOCs研究领域的重要内容。

（3）土壤mVOCs产业化面临的挑战

土壤mVOCs 对作物健康具有潜在的重要影响，发展mVOCs 相关产业有助于绿色农业的发展。由于应用mVOCs 防控土传病害还在起步阶段，因此为推动mVOCs 产业化发展，需要重点考虑以下问题：（a）mVOCs 成分的安全性。由于气体更容易泄露和扩散，因此需鉴定靶标mVOCs 对植物、动物以及人类的毒害作用；（b）靶向mVOCs 的筛选。应避免类似一般化学农药对环境微生物生态的破坏作用，重点筛选出能靶向提高植物免疫和/或削弱根际入侵过程中病原菌的mVOCs；（c）获得特定mVOCs的生产方式。微生物产生的mVOCs 量一般较少，需要化学合成；（d）施用方式。目前已有将mVOCs 作为土壤熏蒸剂应用的案例，但仍需要继续探索高效发挥mVOCs 功能的使用方式，比如能否在根际精准喷施或者在苗期微量熏蒸以激发植物免疫。