芸苔素内酯对糜子苯唑·二甲钠药害的缓解作用

林瑞嫦，高玉萌，王可心，李鑫，杨思敏，高小丽

（西北农林科技大学农学院/旱区作物逆境生物学国家重点实验室，陕西 杨凌 712100）

糜子（L.）具有抗旱耐瘠、耐盐碱、生育期短等优点，是我国北方干旱半干旱地区重要的粮食作物与经济作物。糜子籽粒富含蛋白质、淀粉和矿物质等营养物质，是新时期食物多元化的重要食物来源。

杂草是糜子减产的主要原因，查顺清等指出糜子田杂草以阔叶杂草为主，每年陕西榆林地区因草害导致减产的糜子农田占25%左右。糜子属于直播密植作物，相比于传统人工除草，使用化学除草剂可显著减轻草害、降低生产成本、提高农业生产效率，因此在糜子生产中除草剂的使用具有重要意义。苯唑·二甲钠（WP）是一种由苯磺隆、唑草酮和2 甲4 氯钠三元复配而成的新型复配除草剂。字雪靖研究发现，苯唑·二甲钠对糜子田杂草防效较好，且能显著提高糜子产量。但也有研究表明，除草剂在杀死杂草的同时也会对作物造成一定的药害，抑制作物的生长发育，导致产量降低。

除草剂安全剂是一种可提升作物新陈代谢功能而又不影响除草剂除草效果的有机化合物。目前，利用安全剂来减轻除草剂药害并扩大除草剂杀草范围已成为研究热点。芸苔素内酯（BR）是植物特异性甾体激素，可控制气孔关闭进而提高作物的光合作用，广泛参与其他生理过程并促进植株的生长发育，可有效提高作物在多种逆境（包括除草剂药害）中的抗逆性。周小毛等发现，芸苔素内酯浸种可有效缓解除草剂胺苯磺隆对水稻幼苗的药害。钟杨等发现，干旱胁迫下喷施适宜浓度的芸苔素内酯可促进辣椒幼苗过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）活性和叶绿素含量的增加，降低丙二醛（MDA）含量，减轻干旱对辣椒幼苗的伤害。适宜浓度的芸苔素内酯还可促进糜子叶片叶绿素含量、穗长和地上部生物量的增加，提高糜子产量，缓解阔世玛对糜子的药害作用。目前，未见到芸苔素内酯在缓解除草剂苯唑·二甲钠药害方面的相关报道，因此，本文通过在糜子幼苗期喷施除草剂苯唑·二甲钠后，叶面喷施不同浓度的芸苔素内酯，研究其对苯唑·二甲钠药害的缓解作用和对杂草防效、糜子叶片叶绿素含量、抗氧化酶活性、谷胱甘肽转移酶（GST）活性、MDA 含量、还原型谷胱甘肽（GSH）含量及产量的影响，旨在从糜子叶片生理代谢的角度阐明芸苔素内酯缓解苯唑·二甲钠药害的生理机制，以期为糜子生产中苯唑·二甲钠的安全应用提供理论依据与技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验于2020 年6—10 月在西北农林科技大学榆林小杂粮综合试验示范站（37°56'N，109°21'E）进行，试验地海拔1 229 m，年平均气温8.5 ℃，年平均日照数2 815.8 h，年平均降水量400 mm，降水主要集中在7—9月。

1.2 试验设计

以“榆糜2 号”糜子品种为试验材料，选用的茎叶型除草剂为55%苯唑·二甲钠可湿性粉剂（美国富美实公司），安全剂为0.01%芸苔素内酯可溶性粉剂（河南东立信生物工程有限公司）。本课题组前期的除草剂筛选试验结果发现，苯唑·二甲钠推荐浓度为0.6 kg·hm时对糜子田的杂草防效较好，且对糜子生长发育的负面影响较小，较清水不除草对照增产显著，因此本试验将苯唑·二甲钠浓度设置为0.6 kg·hm。研究表明，在阔世玛胁迫下喷施0.05~0.10 mg·L的芸苔素内酯可有效缓解阔世玛对谷子的伤害，使谷子的株高、叶面积和生物量增大，促进其正常生长。因此本试验将芸苔素内酯浓度设置为0.06、0.08、0.10 mg·L3个浓度。

试验田间种植采取随机区组排列，小区面积为20 m（4 m×5 m），共设置6 个处理：人工除草（CK1）、喷施等量清水不除草（CK2）、0.6 kg·hm苯唑·二甲钠（M1）、0.6 kg·hm苯唑·二甲钠+0.06 mg·L芸苔素内酯（M1S1）、0.6 kg·hm苯唑·二甲钠+0.08 mg·L芸苔素内酯（M1S2）、0.6 kg·hm苯唑·二甲钠+0.10 mg·L芸苔素内酯（M1S3），每个处理4 次重复。待糜子幼苗长至3~4 叶期时，选择晴朗、无风的下午喷施0.6 kg·hm的苯唑·二甲钠。喷药3 d 后，喷施不同浓度（0.06、0.08、0.10 mg·L）的芸苔素内酯缓解药害，采用茎叶喷雾，药液施用量为450 L·hm。

1.3 测定方法及指标

1.3.1 药害指数调查

喷施安全剂芸苔素内酯7 d 后，统一在田间观察并记录糜子叶片的药害及缓解情况，统计各处理重复小区的药害级别及株数，计算药害指数，见公式（1）。药害等级参考字雪靖的药害分级标准：植株正常生长发育、无明显伤害为0 级药害；0~20%的叶片枯黄或带斑点为1 级药害；20%~50%的叶片变黄且卷曲为2 级药害；50%~70%的叶片卷曲枯黄为3 级药害；70%~90%的叶片枯萎或20%死亡为4级药害。

1.3.2 田间杂草防效调查

采用大小为0.25 m的铁丝框随机取样，拔取各处理取样框内的杂草，对杂草鲜质量进行称量，药后15 d 开始调查，之后以15 d 为间隔开展调查，直至糜子成熟，总计调查4 次，糜子田间杂草防效以鲜质量防效表示。

式中：为鲜质量防效，%；为对照 CK2 杂草鲜质量，g；为处理（M1、M1S1、M1S2、M1S3）杂草鲜质量，g。

1.3.3 糜子叶片叶绿素含量测定

喷施芸苔素内酯后，分别在糜子苗期（P1）、拔节期（P2）、抽穗期（P3）、灌浆前期（P4）及灌浆后期（P5）在各处理小区随机选取3 株糜子植株，采用手持式SPAD-502 叶绿素测定仪测定糜子顶部展开叶片的叶绿素含量。

1.3.4 糜子叶片抗氧化酶、GST 活性和 MDA、GSH 含量测定

喷施芸苔素内酯后，分别在糜子苗期、拔节期、抽穗期、灌浆前期及灌浆后期采集糜子顶部展开叶片。每次所取叶片样品放入液氮冷冻保存并储存在-80 ℃冰箱中。POD、SOD、CAT、GST 活性和MDA、GSH 含量采用相应的检测试剂盒测定，试剂盒均购自北京索莱宝科技有限公司。

1.3.5 糜子农艺性状及产量测定

糜子成熟后，各处理随机选取5 株糜子植株进行考种，测量糜子株高、茎粗、穗长、穗质量。各处理重复小区未取样行进行单收计产。

1.4 统计与分析

利用Excel 2007 处理数据，Origin 2017 绘图，SPSS 22 对数据进行分析，Duncan 新复极差法进行差异性分析。表中数据为平均值±标准差。

2 结果与分析

2.1 芸苔素内酯对除草剂药害及杂草防效的影响

由表1 可知，M1 处理在糜子各生育时期的杂草鲜质量平均防效均在80%以上（45 d除外），且随着生育进程的推进呈先减弱后增强的趋势。喷施芸苔素内酯处理（M1S1、M1S2、M1S3）较M1处理杂草防效略有降低，且随着生育进程的推进呈逐渐降低的趋势。M1S1、M1S2、M1S3处理的药害指数均显著低于M1处理，分别较 M1 处理下降了11.34、13.26、12.75 个百分点，说明喷施芸苔素内酯可以显著减轻除草剂苯唑·二甲钠对糜子的药害。

表1 糜子田杂草鲜质量防效和药害指数Table 1 Broomcorn millet farmland weeds' fresh weight control effect and phytotoxicity index

2.2 除草剂及安全剂对糜子叶片叶绿素含量的影响

由表2 可知，随着生育进程的推进，各处理的糜子叶片叶绿素含量呈先升高后降低的趋势，且除M1S3 处理外，其余均在P4 期达到峰值。M1 处理糜子叶片的叶绿素含量较CK1 有所降低（P3 除外），喷施芸苔素内酯后（M1S1、M1S2、M1S3）的糜子叶片叶绿素含量均高于M1 处理，说明叶面喷施芸苔素内酯可提高糜子叶片叶绿素含量，进而提高糜子叶片光合作用，减轻苯唑·二甲钠对叶片叶绿素的不利影响。

表2 糜子叶片叶绿素含量Table 2 Chlorophyll content of leaf of broomcorn millet

2.3 除草剂及安全剂对糜子叶片生理代谢的影响

2.3.1 糜子叶片活性氧代谢

由图1a可知，各处理糜子叶片POD活性随生育期推进呈先增加后减小的趋势，在P4期POD活性达到最大值。M1 处理的POD 活性在 P1 期、P2 期有所上升，且高于CK2，在P3期缓慢上升但开始低于CK2；与M1处理相比，喷施芸苔素内酯处理的POD活性在各时期均有所提升。在P4期，M1S1、M1S2、M1S3处理的POD活性较M1处理分别提升了32.0%、40.1%、33.9%。

由图1b 可知，各处理叶片SOD 活性随生育进程推进呈先升高后降低的趋势，在P4 期SOD 活性达到最大值。M1处理的SOD活性在各时期均为最低且大多时期显著低于CK2；M1S1、M1S2、M1S3 处理的SOD活性均显著高于M1处理且在P4期缓慢上升至峰值，较M1处理分别提高了10.8%、15.4%、8.7%，喷施中浓度芸苔素内酯的M1S2 处理的SOD 活性高于低浓度处理（M1S1）和高浓度处理（M1S3，<0.05）。

由图1c 可知，各处理叶片CAT 活性随生育进程推进呈先增加后减小的趋势，在P4 期CAT 活性达到最大值。M1处理的CAT活性在各时期均最低且显著低于CK2；M1S1、M1S2、M1S3处理的CAT活性在各时期均有所提高且显著高于M1 处理（P1 期M1S1 除外）。在P4 期，M1S1、M1S2、M1S3 处理的CAT 活性较M1 处理分别提升了14.8%、33.3%、26.8%。除P2 期外，其余时期M1S2、M1S3 处理的CAT 活性均高于M1S1处理。

由图1d 可知，各处理的糜子叶片MDA 含量随生育进程推进呈逐渐增加的趋势，在 P3 期、P4 期、P5 期上升迅速。M1 处理的叶片MDA 含量在各时期均显著高于CK2，喷施芸苔素内酯处理的MDA 含量较M1处理均显著下降，不同浓度芸苔素内酯处理间差异不显著（P5 期除外）。M1S2 处理在 P2 期、P3 期及 P5 期的MDA 含量在3 个芸苔素内酯处理中最小，分别较M1 处理显著下降了33.05%、28.48%、20.01%。说明苯唑·二甲钠胁迫下喷施芸苔素内酯可显著降低糜子叶片细胞内的MDA 含量，缓解苯唑·二甲钠胁迫造成的细胞膜脂过氧化，从而减小了苯唑·二甲钠对糜子叶片细胞膜系统的伤害。

图1 糜子叶片活性氧代谢Figure 1 Active oxygen metabolism in the leaves of broomcorn mille

2.3.2 糜子叶片GSH含量和GST活性

由图2a 可知，随着生育进程的推进，各处理叶片GSH 含量先升高后降低，在P4 期GSH 含量达到最大值。与CK2 相比，M1 处理在各时期的GSH 含量均显著降低；M1S1、M1S2、M1S3 处理的 GSH 含量较 M1 处理均有不同程度的提高；M1S2、M1S3 处理的GSH 活性除P5 期外，其余时期均高于M1S1 处理。在P4 期，M1S1、M1S2、M1S3 处理较 M1 处理的 GSH 含量分别显著提高了23.3%、30.8%、25.3%。

由图2b 可知，各处理的糜子叶片GST 活性随生育进程推进呈先升高后降低的趋势，在P3 期GST 活性达到最大值。M1处理的GST活性在各时期均最低且大多时期显著低于CK2；M1S1、M1S2、M1S3处理在各时期的GST 活性均显著高于M1 处理；M1S2、M1S3处理在各时期的GST 活性均高于M1S1 处理。在P3期，M1S1、M1S2、M1S3 处理的 GST 活性较 M1 处理分别显著升高了29.6%、52.4%、39.7%。

图2 糜子叶片GSH含量和GST活性Figure 2 GSH content and GST activity of broomcorn millet leaves

2.4 除草剂及安全剂对糜子农艺性状及产量的影响

由表3 可知，M1 处理的株高、穗长显著低于CK1，茎粗与CK1 无显著差异。叶面喷施芸苔素内酯后，各处理的株高、茎粗均显著高于M1 处理，穗长与M1处理无显著差异，说明苯唑·二甲钠胁迫显著抑制了糜子的生长，叶面喷施不同浓度的芸苔素内酯能减轻除草剂对糜子株高和茎粗的不利影响。

由表3 还可以看出，CK1 的主穗质量最大，达16.67 g；CK2 最小，仅为 8.49 g；M1 处理的主穗质量小于 M1S1、M1S2、M1S3 处理，但无显著差异。从产量来看，CK2产量最低，仅为962.50 kg·hm，CK1产量最高，达4 041.80 kg·hm，M1处理产量仅高于CK2，而低于喷施芸苔素内酯处理。M1S1、M1S2、M1S3 处理的产量均显著高于CK2和M1处理，分别较M1处理增产8.5%、19.7%、11.4%。综上可知，在苯唑·二甲钠胁迫下，喷施不同浓度的芸苔素内酯均能使糜子株高、茎粗、穗长和主穗质量增加，促进糜子正常生长发育，提高产量。

表3 糜子农艺性状和产量Table 3 Agronomic traits and yield of broomcorn millet

3 讨论

大量研究表明，植物在正常生长条件下活性氧（ROS）的产生与消除处于动态平衡，胁迫可导致植物体内产生大量ROS，过多的ROS 打破了平衡状态，使细胞膜质过氧化作用增强，ROS 清除酶结构受到破坏，导致细胞膜相对透性提高、生理代谢紊乱等不良反应。同时ROS 还会对叶绿体和线粒体等细胞器的功能造成损害，造成细胞凋亡，从而抑制作物正常的生长发育，此时植物可通过增加或激活抗氧化酶来防御ROS 对细胞造成的伤害。SOD 作为植物体内ROS 清除系统中最有效的物质，可使O转化成HO，是抗氧化酶系统中的第一道防线，POD 和CAT则是细胞内清除HO的关键酶。MDA 是膜脂过氧化的主要产物，其含量可以反映膜脂的损伤。植物在受到胁迫时通常会提高抗氧化酶活性，增加MDA含量。本研究结果表明，苯唑·二甲钠胁迫下糜子叶片在不同生育期的POD、SOD、CAT 活性均有所下降，MDA 含量显著增加，说明药害程度已经超过了糜子本身的应激能力，糜子体内的抗氧化酶（POD、SOD、CAT）不足以消除因胁迫产生的ROS，此时细胞中ROS 就会造成生物膜的过氧化损伤，细胞膜结构遭到破坏，细胞膜内物质外渗，导致MDA 含量增加，这与肖家昶等的研究结果相近。药后喷施不同浓度的芸苔素内酯均提升了糜子叶片的POD、SOD、CAT 活性，同时显著降低了MDA 含量，说明叶面喷施芸苔素内酯可提升糜子叶片细胞内各抗氧化酶的合成能力，孙石昂等的研究也得出了类似结果。首先通过提高SOD 活性促进糜子叶绿体中水-水循环，使O转化成 HO，接着提高 POD 和 CAT 活性，在过氧化物酶体中直接清除HO，三者协同运作，使自由基维持在一个较低的水平，维持苯唑·二甲钠胁迫下糜子叶片细胞氧化还原的平衡，从而减轻苯唑·二甲钠胁迫对糜子叶片细胞的伤害，维持细胞膜的稳定性，进而降低了糜子叶片细胞内的MDA 含量，有效缓解苯唑·二甲钠胁迫对糜子叶片细胞膜的膜脂过氧化作用，提高糜子对苯唑·二甲钠胁迫引起的氧化胁迫的抵抗能力。同时可减轻ROS 对糜子叶绿体与线粒体等细胞器结构的破坏，延缓叶绿素的分解，减轻苯唑·二甲钠对糜子叶片光合作用及生长发育的抑制作用，有利于糜子叶片的生长及光合作用，最终促进了糜子产量的增加。

除草剂在植物体内的一个重要降解途径就是与GSH轭合，再通过体内的运输系统将其转运到细胞外或液泡内，从而避免除草剂对作物的伤害。这一轭合反应在植物体内是受GST催化完成的，因此作物体内的GSH 含量和GST 活性在一定程度上决定着其对除草剂的解毒程度。本研究结果表明，苯唑·二甲钠胁迫下糜子叶片在不同生育期的GSH 含量和GST 活性均显著降低，药后喷施芸苔素内酯可显著提高糜子叶片的GSH 含量和GST 活性，有效缓解了苯唑·二甲钠对糜子的药害。说明芸苔素内酯缓解糜子苯唑·二甲钠药害的作用机理可能是通过促进糜子叶片细胞内GSH 含量的增加及GST 酶活性的提高，从而催化并提升了苯唑·二甲钠在糜子体内的代谢速率，促进苯唑·二甲钠与GSH 形成无毒性的轭合物排至细胞外或液泡内，从而达到缓解苯唑·二甲钠药害的效果，这与赵颖楠的研究结果一致。

4 结论

（1）在0.6 kg·hm苯唑·二甲钠胁迫下喷施0.06~0.10 mg·L的芸苔素内酯可有效缓解苯唑·二甲钠对糜子的伤害，使糜子叶片叶绿素含量、株高、茎粗、穗长和穗质量增加，促进糜子的生长发育及叶片的光合作用，显著提高糜子产量。

（2）芸苔素内酯缓解糜子苯唑·二甲钠药害的部分机理是通过提高糜子叶片抗氧化酶的酶活性来清除活性氧，维持苯唑·二甲钠胁迫下糜子叶片细胞氧化还原的平衡；同时促进还原型谷胱甘肽含量的增加及谷胱甘肽-S-转移酶活性的提高，催化并加快苯唑·二甲钠在糜子体内的代谢速率，促进苯唑·二甲钠与还原型谷胱甘肽形成无毒性的轭合物。