蒙古栎早烘病发生过程中生理指标的变化规律

刘孝良 赫英姿 贾 姝 于挺红 于 艳

(辽宁省蚕业科学研究所，辽宁凤城 118100)

柞树是柞蚕产业发展的物质基础。我国东北地区柞树资源丰富，柞树在自然环境中容易发生许多病害，如褐斑病、早烘病、白粉病等[1]。这些病害的发生不但危及柞树生长，更危害到柞蚕生产。在柞树众多病害中，柞树早烘病对柞蚕的危害被认为是最严重的一种病害，发病率低的年份达到30%，高的年份达70%，且逐年递增[2]。有关柞树早烘植株的生理生化指标以及光合作用指标的变化均未见报道，但其它植物病害方面的生理指标研究较多。病害发生会伴随植物生理特征的改变，包括叶片中丙二醛含量、叶绿素含量以及地下部分根系的活力等生理指标的变化[3-10]。本文在前人研究基础上，以5 a生根刈蒙古栎植株为材料，研究早烘病发生过程中生理指标的变化规律，以期为柞树早烘病的防治提供理论依据，为柞蚕产业的健康、可持续发展奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选取柞园内前期标定的发病程度基本一致的6株5 a生蒙古栎植株为试验材料，从8月初开始到9月中旬结束，每间隔5天做一次测定及调查，叶片叶绿素、丙二醛含量测定的取样点在材料株春枝“五花头”基部叶片。根活力测定的取样位置，从材料株根部的须根采取，采取深度为15 cm左右，采样的同时调查叶片早烘的严重度及植株的病情指数。

1.2 蒙古栎早烘病叶片发病严重度及病情指数的调查

1.2.1 早烘叶片严重度的调查方法

选取当年“五花头”处基部叶片用游标卡尺测量病斑以及叶片的长度和宽度，分别求出面积，病斑的面积与该叶片的面积比值的百分数即为该叶片的严重度[11-12]。

1.2.2 早烘病病情指数的调查方法

对每个供试植株选同一方位、生长基本一致的主梢上所有叶片进行调查，使调查总叶片数不少于200片，记录总叶片数和感病叶片数[13]。

病情指数={∑(病级株数×代表数值)/[株(叶)数总和×发病最重级的代表数值]}×100。

1.3 蒙古栎发病叶片中叶绿素含量的测定

采取乙醇提取法[14]：采集要测定的叶片样本，快速放入保鲜袋中带到实验室，剪除叶片的主脉，并将样品剪碎混匀，分成6份，每份称重0.20 g，并放入研钵添加少量石英砂、96%乙醇2～3 mL研磨，直到浆糊状，通过滤纸过滤转入25 mL棕色容量杯中，再用96%乙醇滴洗研钵一直到滤纸无绿色为止，以96%乙醇在容量瓶定容，并摇匀，即叶绿素色素提取液，待测。测定仪器为721型风光光度计。测定时将提取液注入比色杯中，96%乙醇为空白对照，在波长649 nm和665 nm处测样本和对照的吸光度，每个样本重复测定3次。

表1 柞树早烘病发病级别的划分

设定D(665 nm)测定结果为X，D(649 nm)测定值为Y，浸提取液中叶绿素浓度计算公式：

叶绿素b(Cb)的浓度(mg/L)=24.96Y-7.32X

叶绿素a(Ca)的质量浓度(mg/L)=13.95X-6.88Y

总叶绿素浓度计算公式：

总叶绿素质量浓度CT(mg/L)=Ca的质量浓度+Cb的质量浓度

取样叶片叶绿素含量计算公式：

叶绿素含量(mg/g)=(CT质量浓度×提取液体积×稀释倍数)/样本鲜量

1.4 蒙古栎叶片中丙二醛含量测定

采用TBA法[14]测定蒙古栎叶片中丙二醛的含量。采取要测定的叶片样本，快速放入保鲜袋中带到实验室，将样品混匀破碎，分成6份，每份称重0.50 g，各加入2 mL 10%TCA、少量石英砂，研磨，并呈匀浆状，后续注入8 mL TCA，充分研磨，然后将研磨后的匀浆以4 000 r/min的转数离心10 min，并取出上清液，备用。提取液与TBA溶液加温反应后进行测定，方法如下：取2 mL提取液并注入2 mL 0.6%TBA溶液混匀后，在沸水浴反应，时间为15 min，对照处理是2 mL蒸馏水加入2 mL 0.6%TBA溶液，冷水快速冷却，以4 000 r/min的转数离心10 min，提取离心后的上清液在721型分光光度计测定450 nm、532 nm和600 nm波长下的吸光值。

样品中丙二醛(MDA)的含量计算公式：

MDA(μmol/g)=(MDA浓度(μmol/L)×提取液体积(mL) / 植物组织鲜重(g)

1.5 蒙古栎根活力的测定

采用TTC法测定根的活力[14]。采集柞树距地面下15～20 cm左右处的须根，以须根的根尖为试验材料。将新鲜的须根(直径<2 mm)剪成0.5 cm长，分6份，每份称取0.4 g，加质量分数为4%的TTC溶液和磷酸缓冲液(pH7.0)各4 mL，在37 ℃恒温箱中暗培养1.5 h，此后立即加入1 mol/L的硫酸2 mL终止反应。提取液的提取：将根取出用蒸馏水冲洗后，转移到研钵中注入2 mL乙酸乙酯持续不断研磨。把收集来的红色提取液，转入带刻度试管中用乙酸乙酯定容至10 mL。利用721型分光光度计在波长570 nm下比色,并与已经做好的TTC标准曲线进行对比，算出测定根部样本TTC还原量。

根活力的计算公式：

根活力[μg/(g·h)]=TTC还原量/(根鲜重时间)

1.6 数据分析

采用EXCLE及SPAD软件，对数据进行处理。

2 结果与分析

2.1 不同严重度的蒙古栎早烘叶片中叶绿素含量的变化规律

蒙古栎早烘叶片中叶绿素含量的测定结果见表2。

由表2可见，蒙古栎叶片中叶绿素含量随着发病叶片严重度的增长而减少，不同严重度的样本间叶绿素含量差异显著。严重度为5%时，叶绿素含量为2.52 mg/g；严重度为34.3时，叶绿素含量为1.8 mg/g，叶绿素含量降低了28.57%。当严重度达到79.3%时，叶绿素含量为0.94 mg/g，较严重度5%时降低62.70%。叶绿素含量与发病叶片严重度关系方程为：y=-0.0168x+2.4545(r2=0.9279)。可见，早烘病发病严重度与叶绿素含量呈负相关性(图1)。早烘病发病过程中的叶片的颜色变化比较显著，和正常的衰老过程有所区别，缺少明显的黄化过程。

表2 不同严重度的蒙古栎早烘叶片中叶绿素含量

图1 叶绿素含量与早烘病叶片严重度的关系

2.2 不同严重度的蒙古栎早烘叶片中丙二醛浓度的变化规律

蒙古栎早烘叶片中丙二醛的含量测定结果见表3。

由表3可见，蒙古栎叶片中的丙二醛(MDA)浓度随着早烘病发病叶片严重度的增长逐渐增大，且不同严重度的样本间差异显著。严重度5.1%时，叶片中丙二醛浓度为2.5 umol/g；当严重度发展到50%时，丙二醛(MDA)的浓度上升到4.3 umol/g，增长了72%。图2可见，叶片中丙二醛浓度与严重度呈正相关性，叶片中丙二醛(MDA)含量与严重度关系为：y=0.8781ln(x)+1.0459(r2=0.9833)。丙二醛(MDA)浓度的变化分为两个阶段：严重度从0到20%，丙二醛(MDA)浓度迅速增大；达到50%以后，柞树早烘病进入暴发期，丙二醛(MDA)浓度增大的幅度趋于平缓。

表3 不同严重度的蒙古栎早烘叶片中丙二醛浓度

图2 叶片中丙二醛浓度与发病严重度的关系

2.3 蒙古栎早烘病病情指数与根活力变化规律

蒙古栎早烘病病情指数与根活力的计算结果见表4、图3。

表4 蒙古栎早烘病病情指数与根活力变化关系

由表4可见，蒙古栎根系活力随着早烘病病情指数的增加逐渐下降，不同病情指数间根活力差异显著，早烘病病情指数从20到40的变化过程中根活力降低幅度最大。当根活力降低到350.6 μg/(g·h)，病情指数达到52，已不适合柞蚕食用。

由图3可知早烘病病情指数与根活力变化呈指数关系，数据模型：y=1682.3e-0.029x(r2=0.9806)。

图3 蒙古栎早烘病病情指数与根活力的关系

3 结论与讨论

叶绿素含量是反映光合作用强弱的生理指标。蒙古栎早烘病在发病过程中，叶绿素含量随着早烘病发病叶片严重度的增长而降低。叶绿素含量与蒙古栎早烘病发病叶片的严重度具有负相关性，呈线性关系：y=-0.0168x+2.4545(r2=0.9279)。

丙二醛含量可以反映植物抗逆性指标，是作为细胞膜损伤程度的评价指标而影响细胞生理生化过程[15]。丙二醛含量的持续增加表明蒙古栎叶片中有大量的自由基被释放出来，进而破坏了其他细胞器。丙二醛与蒙古栎发病叶片严重度有对数关系：y=0.8781ln(x)+1.0459(r2=0.9833)。丙二醛含量随着严重度的增长而增加，说明蒙古栎早烘病发病过程中积累了大量的自由基，当含量积累到4.3 umol/g时候，蒙古栎叶片早烘严重度达到50.8，已不能被柞蚕食用。小麦品种对梭条斑花叶病毒病抗病特性的研究表明，丙二醛含量增加速率与品种抗病性呈负相关[16]，根据丙二醛含量与蒙古栎早烘病关系，是否可以把丙二醛含量作为筛选蒙古栎抗早烘病品种的生理指标之一还需继续研究。

根活力是反映根系生命活力的生理指标，从根活力的强弱中可以看出，根对营养物质的吸收能力是根系重要抗逆性指标，同时与植物的衰老有着直接关系。根活力变化与蒙古栎早烘病病情指数呈指数关系：y=1682.3e-0.029x(r2=0.9806)。在柞树生长过程中，8月中下旬开始进入生长后期，相应的生理指标也趋于衰老状态，根活力处于下降趋势，但发病重的柞树根活力提前下降。可见，提高根活力对降低柞树早烘病的病情指数有积极作用。