安康市桑树褐斑病致病菌分离鉴定

梁嘉俊 凌 君 楚 渠 彭云武

(1.安康学院陕西省蚕桑重点实验室，陕西安康 725000；2.西北农林科技大学蚕桑丝绸研究所，陕西杨凌 712100)

桑树褐斑病是依据染病叶片病斑形态进行分类的一类桑树叶部病害，又名“烂叶病”“焦斑病”，其典型症状是在桑叶上形成近圆形或不规则形状的褐色坏死病斑。桑树褐斑病分布广泛，在我国大部分蚕区桑园均有发生[1-3]，发病严重时会导致桑园大面积减产[3]，严重影响桑叶品质与产量。2019—2021年在安康市调查时发现，每年8—10月份桑园褐斑病发生频率高，病害严重时可使桑园减产50%以上，影响蚕茧生产和桑叶资源加工利用，导致桑园经济效益下降。本研究对安康市桑园褐斑病致病菌进行了分离鉴定，明确导致褐斑病发生的主要致病菌，为建立更有效的桑褐斑病防治提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 病样采集及病原菌分离纯化

2020年8月于安康学院陕西省安康市汉滨区恒口蚕桑试验基地桑园内采集感病桑叶。按照常规组织分离法[4]分离培养，待菌丝长出后根据菌落特征分离纯化，单一菌株再接入PDA培养基中扩大培养，并移入PDA斜面培养基4℃保存备用。

1.2 病菌形态及显微观察

将菌株接于PDA平板于25℃黑暗培养一周后，观察并记录菌落特征；光学显微镜观察并记录菌丝结构、分支和隔膜的有无等显微形态特征，根据真菌分类系统初步进行种类鉴定[5]。

1.3 菌株基因组DNA提取及ITS序列PCR扩增

按照刘丽[6]的方法提取待测菌株DNA。采用真菌rDNA-ITS基因通用引物EF-1H(5'-ATGGGTAAGGAAGACAAGAC-3')和EF-2T(5'-GGAAGTACCAGTGATCATGTT-3')[7]。PCR扩增体系：2×Taq PCR MaterMix 12.5 μL，上下游引物各1 μL，DNA模板1 μL(对照加1 μL 双蒸水)，最后用双蒸水补足至25 μL。ITS基因PCR扩增程序: 94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，34个循环；72 ℃延伸5 min。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测以后，委托西安擎科泽西生物科技有限公司进行序列测定。

1.4 病原菌EF-1α序列分析

测序结果在NCBI数据库中进行BLAST分析，然后使用MEGA7.0[8]软件进行序列间对比分析，构建分子系统树，分析各菌株间同源性。

1.5 菌株致病性试验

接种对象选用在温室培养桑特优2号桑苗的叶片，接种前，先用自来水冲叶片表面，然后用0.5%的吐温-20完全浸泡叶片5～10 s至叶片表面无气泡。接种方法采用菌饼法接种(菌饼直径约3 mm)，并分别设空白对照。

先在9.5 cm规格培养皿中放入两层滤纸，吐温-20处理后用脱脂棉包裹叶柄保湿，选取桑苗上长势良好无创伤的叶片为一个接种处理，每个培养皿中放入1—2片桑叶。用打孔器分别取若干3 mm菌饼，每个叶片上放3个菌饼，重复数为5，加入无菌水覆盖培养皿底部。同时设空白无菌饼为对照，接种两天后从叶片上取走菌饼，防止叶片细胞呼吸受阻死亡而使叶片变黄影响观察，每天观察叶片发病情况并拍照统计。

2 结果与分析

2.1 桑叶褐斑病症状

桑叶上出现近圆形或形状不规则的褐色坏死病斑，病斑边缘叶面枯黄褪绿，死亡组织呈褐色，干枯皱缩(图1)。

图1 桑树褐斑病发病症状

2.2 病原菌菌落及显微照片

该病原菌生长迅速，在PDA培养基上25 ℃培养4 d可长满整个培养皿，菌落成灰白色平铺于培养基上(图2A)，背面呈淡黄色(图2B)，气生菌丝呈绒毛状，稠密(图2A)。显微形态：大型分生孢子呈镰刀型，3～5隔，大小为(20.72～25.59μm)×(4.63～5.22μm)；小型分生孢子数量多，卵圆形，大小为(14.89～18.47μm)×(3.25～4.37μm)(图2C)。

A-菌落正面 B-菌落背正面 C-病原菌显微结构

2.3 分子生物学鉴定

将所提取出的病原菌DNA作为模板，用真菌ITS通用引物ITS1/ITS4做PCR扩增，产物经5 μL点样电泳后进行EB染色，在紫外凝胶成像系统下拍照如图，条带单一较亮，且无非特异性扩增条带，分布在500～750 bp之间。

测序结果分析表明其序列总长度为678 bp，G+C含量为50.74% ，病原菌序列与 GenBank 及中已有的序列进行核酸 BLAST 比对分析，选取与Genebank中已有序列同源性较高的菌种信息，用于系统发育分析。

用 Mega7.0 软件进行多序列比对，采用 K2 模型，用邻接法(Neighbor-joining Method)构建rDNA-ITS 序列的系统进化树(图3)。

分析rDNA-EF-1α序列构建系统进化树，分支上侧数字为大于50%的Bootstrap检验值(1 000次重复)，结果表明：在遗传距离为0.02，Bootstrap为1 000次检验时，病原菌rDNA-EF-1α序列seq与F.fujikuroi(登录号：MN958238.1)且置信度为100，说明本试验研究的桑树褐斑病病原菌为藤仓镰刀菌F.fujikuroi。

图3 基于EF-1α基因序列的进化树

2.4 致病性测定

接种7 d后开始出现明显症状(图4-A)，接种叶片上具有不规则的褐色病斑，斑点周围有少许退绿现象。发病症状与田间发病症状相似，而对照组没有出现任何发病现象(图4-B)。

A-接种7d后症状 B-对照组

接种菌株后发病桑叶组织经分离、纯化获得的菌株与原接种物的菌落特征及分生孢子形态完全一致，将再分离菌株进行分子鉴定，和待测菌株为相同菌株，证明原接种菌株为桑树褐斑病的致病菌。

3 讨 论

2015年，中国工程院院士向仲怀教授提出 “立桑为业、多元发展”的桑产业发展理念[9]，旨在拓展桑树资源多功能利用，促进蚕桑产业由以蚕丝为主的单一产业向蚕桑并重的多元化产业发展，拓展桑树药食用途、饲料用途和文化生态用途等新功能。但是，桑园叶部病害对于收获高品质桑叶产生了极大的损害。在2019—2021年对安康市各县区桑园病害调查中发现，桑园内病害复杂，常见有褐斑病、轮纹病、叶枯病等真菌性病害和青枯病等细菌性病害以及萎缩病等病毒性病害。其中，在每年8—10月份，各县区桑园均以褐斑病和轮纹病为主，这与云南大理州桑褐斑病发病时期相似[3]，可能是因为进入雨水增多时期，桑园内湿度增加，加剧褐斑病病原菌的传播侵染。

本研究中，通过对染病桑叶进行病原菌分离纯化，结合常规菌物鉴定和分子鉴定方法，根据科赫氏法则重新接种鉴定，认为藤仓镰刀菌F.fujikuroi是安康地区桑树褐斑病的主要致病菌，而据文献[10-11]报道，云南蚕区桑树褐斑病主要是由桑粘隔孢(Septogloeum mori Briosi et Cavara)和壳丰孢属(Phloeospora sp.)病原菌引起，这与本研究的结果有所不同。褐斑病是通过病斑特点加以命名的一类病害，多种致病菌均可导致褐斑病的发生[12,13]。在安康地区桑树褐斑病致病菌调查过程中，分离到多种镰刀菌属真菌，发现部分镰刀菌属菌株或具有致病性。因此，笔者认为，安康地区桑树褐斑病可能是由多种镰刀菌共同侵染所致，这与已有研究结果有所差别，可能和地理环境及气候因素等有关，具体原因仍有待进一步研究。