小鼠腹腔引流管载体介导的铜绿假单胞菌生物被膜感染模型的建立

刘晓岚 周志坚 张真强 秦海洸 刘晓庆 荆雪宁 孔晋亮 宋志军 吴红

[摘要]目的探討如何利用腹腔引流管载体建立小鼠腹腔铜绿假单胞菌（PA）生物被膜（BF）感染的模型，为进一步研究 PA BF 体内感染的致病性、耐药机制及其防治提供研究平台。方法利用临床常用的腹腔引流管切成圆片在体外预先建立 PA BF 感染的载体，然后把载体植入小鼠的腹腔造成 BF 感染的动物模型。1 d 后评估小鼠腹腔的感染情况、细菌学和病理学的改变等。结果小鼠腹腔载体植入1 d 后取出引流管载体，可见 PAO1组载体表面有生物被膜样结构存在，并培养出铜绿假单胞菌活菌，腹腔载体周围包裹组织呈现出急性炎症改变;术后第2天， PAO1组小鼠比空白对照组小鼠体表温度较前1 d 增高更明显，体重较前1 d 降低更明显，差异有统计学意义（P <0.05）。结论体外制作的腹腔引流管 PA 生物膜载体植入体内可诱发小鼠腹腔 PA BF 感染，模拟体内留置导管引起的 PA BF 感染的情况，对这种难治性感染的基础研究提供了可靠的动物模型。

[关键词]引流管;铜绿假单胞菌;生物被膜;模型

[中图分类号] R378  [文献标识码] A   [文章编号]2095-0616（2022）07-0031-05

Establishment of a mouse model of abdominal drainage tube carrier-mediated Pseudomonas aeruginosa biofilm infection

LIU  Xiaolan    ZHOU  Zhijian2      ZHANG  Zhenqiang3      QIN  Haiguang1LIU  Xiaoqing1JINGXuening1KONGJinliang4SONGZhijun5WUHong6

1. Department of Medicine， Shandong College of Traditional Chinese Medicine， Shandong， Yantai 264199， China;2. Department of General Surgery， Yidu Central Hospital of Weifang， Shandong， Qingzhou 262500， China;3. Department of Respiratory Medicine and Intensive Care Unit， Liuzhou People’s Hospital， Guangxi， Liuzhou 545006， China;4. Department of Respiratory Medicine and Intensive Care Unit， the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University， Guangxi， Nanning 530021， China;5. Department of Clinical Microbiology， Hospital South West Jutland， University Hospital of Southern Denmark， Denmark， Esbjerg;6. Department of Clinical Microbiology， Rigshospitalet， University Hospital of Copenhagen， Denmark， Copenhagen

[Abstract] Objective To investigate how to establish a model of Pseudomonas aeruginosa （PA） biofilm （BF） infection in the mouse abdominal cavity using an abdominal drainage tube carrier， so as to provide a platform for further study of the pathogenicity， drug resistance mechanism and prevention and treatment of PA-BF infection in vivo. Methods  The carrier for PA-BF infection was established in vitro by using sliced discs of the commonly used abdominal drainage tube and then the carrier was implanted into the abdominal cavity of mice to create an animal model of BF infection.1 day later， the infection status， bacteriological and pathological changes in the abdominal cavity of micewere evaluated. Results When the drainage tube carrier was removed 1 day after implantation， BF-like structures were observed on the surface of the carrier in the PAO1 group， live PA were cultured， and acute inflammatory changes wereobserved in the surrounding tissues of the carrier in the abdominal cavity. On the second day after surgery， the mice in the PAO1 group showed a more significant increase in body surface temperature and a more significant decrease in body weight than those in the blank control group on the previous day， with statistically significant differences（P <0.05）. Conclusion The in vivo implantation of PA- BF carrier made by using an abdominal drainage tube in vitro can induce abdominal PA-BF infection in mice and simulate the situation of PA-BF infection caused by indwelling catheters in vivo ， thus providing a reliable animal model for the basic study of this refractory infection.

[Key words] Drainage tube; Pseudomonas aeruginosa; Biofilm; Model

引流管是一种临床常用的将人体组织间或体腔中积聚的脓液、血液、渗出液等引流至体外，防止术后感染、促进愈合的一种医疗器械。临床上常见的有胸腔引流管、腹腔引流管、脑室引流管、胆管引流管、泪道引流管、脑脊液引流管、腰椎引流管等。一般采用硅橡胶或聚氨酯等材料制成，无菌提供，一次性使用。引流管留置体内很有可能出现引流管表面铜绿假单胞菌（P. aeruginosa， PA）、大肠杆菌、葡萄球菌等细菌生物被膜（biofilms， BF）感染，加重病情和疾病的复杂性，甚至影响临床治疗[1-4]。因此，如何减少或避免引流管留置引发的感染是相关临床工作的重要课题之一。本研究在张真强等[5-7]相关实验的基础上进行改良，首先体外采用临床上常用的一次性引流管切片建立稳定 PA BF 感染的载体，然后把载體植入正常小鼠的腹腔造成 BF 感染，模拟体内留置引流管引起的 PA BF 感染的情况，对这种难治性感染的基础研究提供方便可靠的动物模型，有利于对相关疾病的致病特点和防治开展进一步的研究。

1材料与方法

1.1 实验菌株

铜绿假单胞菌 PAO1野生型菌株（丹麦哥本哈根大学医院临床微生物科惠赠）。

1.2 载体

将临床通常所用的一次性引流管（苏州鑫达医疗器材有限公司）切割成小圆片（直径约5 mm），然后高压蒸汽灭菌。37℃恒温摇床中培养PA 20 h，然后将细菌浓度调整至 OD600=0.05，24孔板每孔分别加入2.0 ml 生理盐水和调好的菌液浸泡引流管载体，37℃恒温培养20 h 后取出，用生理盐水冲洗两遍后备用（留样送电镜扫描观察）。

1.3 主要试剂和仪器

LB 琼脂（中国陆桥技术责任有限公司），HE 染色试剂盒（索莱宝），无水乙醇等其他试剂均为国产分析纯。扫描电子显微镜（SEM，捷克 TESCAN）、正置荧光相差显微成像系统（OLYMPUS， BX53F）、酶标仪（美国ThermoMultiskan MK3），普析通用 T6新世纪紫外可见分光光度计（上海精密科学有限公司），生物安全柜（苏州净化设备有限公司， BHC-1300I-IA/B2），漩涡振荡器仪（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）， SPX-3003-Ⅱ型生化恒温培养箱（上海跃进医疗器械厂），倍尔康非接触式红外体温计（JXB-178，广州市金鑫宝电子有限公司），台式低温高速离心机（5410R，德国 EPPENDOF），超低温冰箱（Thermo 995）。

1.4 动物分组及模型建立

将16只清洁级健康雌性 KM 小鼠（18～22g）（广西医科大学动物实验中心提供，动物合格证号： SCXK 桂2014-0002）随机分成空白对照组（8只）、PAO1组（8只）。标准鼠粮、自由饮水饲养1周。4%水合氯醛0.1 ml/10 g 腹腔麻醉，局部消毒后于左下腹打开6～8 mm 切口逐层进入腹腔，将载体用无菌生理盐水轻轻冲洗后分别放入相应组小鼠腹腔，然后缝合切口。饲养1 d 后处死小鼠观察感染情况：载体取出用连续稀释法进行活菌计数;载体周围感染的腹腔组织按照病理学常规制作石蜡切片，HE 染色后在光学显微镜下观察，分析 PA BF 体内感染后的病理变化。

1.5 统计学方法

采用 SPSS 19.0统计学软件进行实验数据分析，计量资料以均数±标准差（x ± s）表示，两组间比较采用独立样本 t 检验，以 P <0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1 引流管载体扫描电镜观察

PAO1组载体进行扫描电镜检查，可见术前载体表面大量细菌附着，局部有黏附聚集结构，见图1。术后载体表面有 BF 样结构，其中有杆状菌存在，见图2。

2.2 腹腔留置导管载体活菌计数

PAO1组腹腔留置导管载体取出后培养出 PA 菌落，菌量为（5.42±0.39）lg（CFU/ml），空白对照组载体未培养出细菌。

2.3 腹腔载体周围组织的病理学改变

PAO1组腹腔载体周围组织可见明显炎症反应，大量中性粒细胞等炎症细胞浸润，并有少量组织细胞变性、坏死，空白对照组腹腔载体周围组织未见明显炎症反应，见图3～4。

2.4 感染模型评估

16只小鼠全部存活并完成实验，两组死亡率均为0。术后小鼠精神萎靡，活动少，饮食少，其他一般情况可。术后第2天上午9时检测发现小鼠体表温度较前1 d 增高，PAO1组增高（0.84±0.39）℃，

明显高于空白对照组的（0.30±0.14）℃，差异有统计学意义（t=-3.643， P=0.006）;而小鼠体重大多较术前降低， PAO1组降低（1.76±0.79）g，明显高于空白对照组的（0.93±0.45）g，差异有统计学意义（ t=2.604， P=0.024）。解剖小鼠可见 PAO1组小鼠腹腔中有轻重不等的渗液，载体附近肠管粘连、局部脓肿形成;空白对照组腹腔内无明显积液及粘连，载体表面光滑，呈游离状态，局部无脓肿形成，见图5～6。结合以上电镜、病理学、细菌学检查结果，可证明腹腔引流管载体介导的 PA BF 感染模型建立成功。

3讨论

在 PA BF 感染性疾病的基础研究中，稳定且有临床意义的动物模型建立一直不理想，制约着这方面的研究进展[8-9]。张真强等[5]课题组建立的 PA 新西兰兔脓胸模型成功模拟了胸腔闭式引流等造成 PA 脓胸这种院内感染，为继续进行 PA 在胸腔环境中的生长特性和耐药机制的研究及治疗方案的探索提供了科学的实验基础和理论依据。而临床上腹腔引流管的使用更加常见，所引起的相关感染问题非常值得关注。临床腹腔引流管主要分为治疗性引流管和预防性引流管。治疗性引流管主要用于感染性疾病，预防性引流管往往在外科、妇产科术后用来引流脓液、肠液、胆汁、血液、渗出液等，对治疗有积极作用，但是这也可能是细菌附着增殖、发生感染的通道，尤其是自身抵抗力差的患者通过留置的引流管引起感染也可能加重病情，所以现在加速康复外科提倡尽早拔除腹腔引流管[10]。对于外科患者来说，手术部位感染（surgical  site infection， SSI）是最常见的医院获得性感染之一，导致发病率、病死率和医院资源的消耗增加，其中手术部位的引流是手术部位感染的一个重要的危险因素。引流管使用时间是手术部位感染发生的独立危险因素，超过3 d 的时间，手术部位感染则往往与引流管的使用有关，预防性腹腔引流管留置时间的延长会导致器官/空间手术部位感染风险明显增加[11-12]。预防性腹腔引流液微生物感染种类总结发现，PA 感染发生率在全球范围位于前5位，而且极易引起 BF 感染，加重治疗难度[13-14]。重症腹腔感染（intra-abdominal infection，IAI）病情复杂，多并发多器官功能障碍综合征等，持续时间长、病死率高，临床治疗困难，常需多个学科联合采用抗菌药物、连续血液净化、外科干预（微创经皮穿刺引流或开腹引流，甚至腹腔开放治疗）等治疗才能取得良好效果[15]。抗菌药物的使用极易导致部分细菌出现多重耐药、交叉耐药甚至广泛耐药现象，耐药菌会给临床治疗带来严重威胁[16]，因此需要寻找有效治疗的新策略和进一步的动物实验来研究科学的药理学配方。

本实验采用临床外科广泛使用的一次性引流管切成圆片作为植入腹腔的载体，载体表面预先建立 PA BF 感染，然后移植到正常小鼠的腹腔内造成感染，模拟外科腹腔留置引流管引起的PA BF 感染，感染动物模型的成功建立为这种难治性感染的后期实验研究提供了条件，在此基础上可以继续观察不同细菌感染、不同时间的病情变化，以及给予不同抗生素、中医中药等治疗的效果。本研究已经通过该动物模型证实感染3 d 后，lasR/rhlR基因缺陷组小鼠的腹腔炎症反应明显轻于 PAO1野生型组，提示 PA 群体感应系统的lasR、rhlR基因在 PA BF 体内感染中发挥致病作用[17]。利用有效的動物模型开展进一步深入研究可为临床相关感染的防治提供科学依据。

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（收稿日期：2021-03-02）